賀學(xué)英，王 蕊，王會(huì)如

(北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京101111)

醫(yī)療器械細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)化探討

賀學(xué)英，王 蕊，王會(huì)如

(北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京101111)

細(xì)胞毒性是醫(yī)療器械生物相容性評價(jià)的重要項(xiàng)目之一。四唑鹽MTT法是經(jīng)典定量細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法，該實(shí)驗(yàn)研究了細(xì)胞濃度、培養(yǎng)時(shí)間對試驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明應(yīng)用不同試驗(yàn)條件的MTT法對同一待檢物會(huì)得到不同的細(xì)胞毒性結(jié)果，因此標(biāo)準(zhǔn)化MTT試驗(yàn)方法對醫(yī)療器械細(xì)胞毒性試驗(yàn)評價(jià)非常重要。

MTT法細(xì)胞毒性試驗(yàn);細(xì)胞生長曲線;L929細(xì)胞系

0 前言

細(xì)胞毒性是醫(yī)療器械生物相容性評價(jià)的重要項(xiàng)目之一。GB/T16886.5－2005《醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)—體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)(ISO 10993.5:1999，IDT)》中給出了浸提液法、直接接觸法、濾膜擴(kuò)散法等方法的原則，并簡要介紹了細(xì)胞毒性可定性或定量評價(jià)，但該標(biāo)準(zhǔn)并未給出各方法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)。MTT法是一種經(jīng)典的定量細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法，GB/T14233.2－2005給出了該方法的SOP，目前國內(nèi)廣泛采用這一方法對醫(yī)療器械進(jìn)行細(xì)胞毒性評價(jià)。我國尚未轉(zhuǎn)化的ISO10993－5:2009(以下稱2009版國際標(biāo)準(zhǔn))較1999年版本發(fā)生了較大變化，新版標(biāo)準(zhǔn)具體化了細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法，在附錄c中詳細(xì)給出了MTT法細(xì)胞毒性試驗(yàn)的SOP，該SOP與GB/T14233.2－2005給出方法有較大不同。不同的MTT試驗(yàn)方法對同一待檢物會(huì)是否能得出一致的結(jié)果是本研究要解決的問題，這關(guān)系到能否對待檢物做出客觀科學(xué)的評價(jià)。

1 材料與方法

(1)L929細(xì)胞系(ATCC)，MEM細(xì)胞培養(yǎng)基，3－(4，5－二甲基噻唑－2) －2，5－二苯基四氮唑溴鹽(簡稱MTT)。

(2)取100μL濃度為1×104/mL，1.5×104/mL，2× 104/mL，5×104/mL，8×104/mL，1×105/mL，2×105/mL的L929細(xì)胞分別接種于96微孔板中，相當(dāng)于每孔分別接種細(xì)胞數(shù)約1×103，1.5×103，2×103，5×103，8×103，1×104，2×104，培養(yǎng)4 h～120 h，每24 h以MTT摻入的方式監(jiān)測細(xì)胞增殖情況并繪制生長曲線。

(3)同一被檢物分別應(yīng)用 GB/T14233.2－2005及ISO10993－5:2009給出的MTT試驗(yàn)方法檢測其細(xì)胞毒性。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同起始細(xì)胞密度L929細(xì)胞生長曲線測定

當(dāng)接種濃度較低為1×104/mL，1.5×104/mL，2×104/mL時(shí)，L929細(xì)胞在72 h之前都處于增殖緩慢狀態(tài);在8× 104/mL，1×105/mL兩個(gè)個(gè)濃度下，細(xì)胞在生長24 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，并在72～96 h進(jìn)入平臺期;2×105/mL濃度組細(xì)胞貼壁后即進(jìn)入對數(shù)生長期，48 h起即進(jìn)入平臺期。如表1，不同起始接種濃度L929細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間生長增殖情況，以酶標(biāo)儀570nm與630nm測定吸光度差值表示;圖1直觀顯示了細(xì)胞生長曲線。

表1 不同接種密度L929細(xì)胞增殖情況

細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)生長期之前，對生長環(huán)境的變化反應(yīng)較敏感，因此為排除細(xì)胞本身生長帶來的干擾，細(xì)胞毒性試驗(yàn)應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期階段給予刺激物，以真實(shí)反應(yīng)待檢物對細(xì)胞生長的抑制程度，這一點(diǎn)在2009版國際標(biāo)準(zhǔn)中特別進(jìn)行了強(qiáng)調(diào)。

2.2 同一被檢物細(xì)胞毒性試驗(yàn)

選取一高分子材料分別應(yīng)用 GB/T14233.2－2005及ISO10993－5:2009給出的MTT試驗(yàn)方法檢測其細(xì)胞毒性，結(jié)果如下:

(1)GB/T 14233.2－2005中8.5.6 a)方法:L929初始接種濃度為1×104/mL，生長24 h后加入待檢物浸提液，培養(yǎng)72 h，細(xì)胞相對增殖率為15.9%，可判為有毒性。

圖1 L929細(xì)胞在不同起始密度生長曲線

(2)ISO 10993－5:2009附錄c方法:L929初始接種濃度為1×105/mL，生長24 h后加入待檢物浸提液，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞相對增殖率為94.3%，可判為無毒性。

同一待檢物以不同MTT試驗(yàn)方法得到完全不同的細(xì)胞毒性結(jié)果，對需做出依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果做出合格判斷的機(jī)構(gòu)來說會(huì)帶來很大困惑。

從圖1生長曲線可以看出GB/T 14233.2－2005方法要求接種細(xì)胞的初始濃度較小，細(xì)胞在生長24 h后還未進(jìn)入對數(shù)生長期，對任何因素的變化都會(huì)有較敏感的反應(yīng)，可能會(huì)放大待檢物微小的細(xì)胞抑制作用;而在ISO 10993－5: 2009方法中，細(xì)胞初始接種量是GB/T 14233.2－2005的10倍，24 h后細(xì)胞已進(jìn)入對數(shù)生長期，可較客觀地反應(yīng)待檢物對細(xì)胞生長的影響。

根據(jù)細(xì)胞生長曲線，還有一個(gè)需要特別注意的問題:“加入待檢物后，細(xì)胞還應(yīng)培養(yǎng)多久?是不是越久越能反應(yīng)出待檢物的毒性?”

2009版國際標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定:在待檢物作用24 h后細(xì)胞讀取結(jié)果，這時(shí)候?qū)φ战M細(xì)胞仍應(yīng)處于對數(shù)生長期，實(shí)驗(yàn)組與處于對數(shù)生長期的對照組相比較得到其真實(shí)增殖率;如果待檢物加入后培養(yǎng)48 h或更長時(shí)間，從圖1可以看到，這時(shí)候?qū)φ战M已開始進(jìn)入平臺期，進(jìn)入平臺期后細(xì)胞的增殖會(huì)受到抑制并開始凋亡，而當(dāng)待檢物對細(xì)胞只有抑制作用而非殺傷作用時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長達(dá)到平臺期的時(shí)間會(huì)延后，經(jīng)過較長時(shí)間的培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖程度可能反而會(huì)趕上或超過對照組，當(dāng)計(jì)算相對增殖率時(shí)會(huì)得到假陰性結(jié)果，也就是說有時(shí)延長培養(yǎng)時(shí)間反而不能反映出待檢物的細(xì)胞毒性。

綜上，MTT試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)需明確規(guī)定合理的細(xì)胞初始接種量及待檢物加入后的培養(yǎng)時(shí)間，不能在SOP中出現(xiàn)彈性的要求，如“加入待檢物后培養(yǎng)時(shí)間不小于24 h”，或“培養(yǎng)24～72 h”;當(dāng)細(xì)胞相對增殖率超過100%時(shí)，要特別密切關(guān)注試驗(yàn)的原始吸光值，分析結(jié)果是否合理;如應(yīng)用編好的程序直接讀取細(xì)胞相對增殖率，不記錄原始吸光值度，則會(huì)產(chǎn)生較大風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

應(yīng)依據(jù)所應(yīng)用細(xì)胞系生長特性，選擇MTT法細(xì)胞毒性試驗(yàn)條件，并應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，隨意改變試驗(yàn)條件會(huì)得到不同的試驗(yàn)結(jié)果，不利于對醫(yī)療器械細(xì)胞毒性進(jìn)行客觀、科學(xué)的評價(jià)。

［1］GB/T 14233.2－2005醫(yī)用輸血、輸液、注射器具檢驗(yàn)方 第2部分:生物學(xué)試驗(yàn)方法［S］.

［2］ISO10993－5:2009 Biological evaluation of medical devices—Part 5:Tests for in vitro cytotoxicity［S］.

R197.39

A

1002－2376(2015)07－0009－02

2015－05－04