陳文良， 陳文龍， 王 敏， 朱 偉*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510006）

Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑純化土茯苓多糖的工藝研究

陳文良1，2， 陳文龍1， 王 敏1， 朱 偉1，2*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510006）

目的考察Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑在土茯苓總多糖中的純化效果。方法采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以多糖保留率和蛋白清除率為指標(biāo)，考察天然澄清劑加入量、料液比、純化時(shí)間和溫度四個(gè)因素的最佳工藝條件。結(jié)果Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑純化土茯苓總多糖的最佳提取工藝為天然澄清劑b組分加入量為2%，a組分為1%，料液比為1∶15，純化時(shí)間120 min，溫度為80℃，多糖保留率為94.07%，蛋白清除率為55.59%。結(jié)論Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑純化土茯苓總多糖的工藝簡(jiǎn)單可靠，合理可行，為土茯苓多糖的純化和開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

土茯苓；多糖；正交試驗(yàn)；天然澄清劑；純化

土茯苓為百合科植物光葉菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根莖，氣微，味微甘，澀。具有除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)等功效?？捎糜谥委熋范炯肮卸舅碌闹w拘攣，筋骨疼痛；濕熱淋濁，帶下，癰腫，瘰疬，疥癬等［1］。近年來(lái)藥理與臨床研究表明土茯苓在抗動(dòng)脈硬化，抗癌及治療心腦血管疾病等方面有良好效果［2］，文獻(xiàn)表明土茯苓多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能及抗癌等多方面的作用［3］，其主要成分是己糖和淀粉等，具有很好的開發(fā)利用前景。

Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑是新型食品添加劑，由兩部分組成。其原理是第一組分加入后，在不同的可溶性大分子間 “架橋”連接，使分子迅速增大，第二組分在第一組分所形成的復(fù)合物基礎(chǔ)上再 “架橋”，使絮狀物盡快形成［4］。第一組分的加入量是第二組分的2倍。Ⅱ型ZTC1+ 1天然澄清劑主要用于除去藥液中的蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂等膠體不穩(wěn)定成分，而保留藥液中的多糖、高分子物質(zhì)和可溶性固體物等，且效果優(yōu)于傳統(tǒng)的水提醇沉法，具有簡(jiǎn)便、有效、價(jià)廉、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)［5］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑純化土茯苓多糖的工藝進(jìn)行了研究，為土茯苓多糖的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Rotavapor R-215減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；VICTOR X5酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer公司）；BS224S萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；XMTD-8222電熱恒溫水浴鍋 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；B600A醫(yī)用離心機(jī) （安新縣白洋離心機(jī)廠）；RT-04四兩裝高速中藥粉碎機(jī) （武義縣屹立工具有限公司）。

Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑 （天津振天成科技有限公司，批號(hào)120726）；D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110833-200503）；牛血清白蛋白 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20130121）；考馬斯亮藍(lán)G-250（上海博谷生物科技有限公司，批號(hào)20120307）；重蒸苯酚 （北京普博新生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)PBZ0501）；濃硫酸 （優(yōu)級(jí)純，天津市進(jìn)豐化工有限公司，批號(hào)20110205）；磷酸、醋酸、三氯甲烷、正丁醇皆為分析純。

土茯苓藥材（康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)130800051），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院陳燕芬主任中藥師鑒定為百合科植物土茯苓Smilax glabra Roxb的干燥根莖，符合 《中國(guó)藥典》2010年版中關(guān)于土茯苓藥材的要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 澄清劑的配置 Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑由a，b兩組分組成。a組分：精密量取1.0 g a組分，加入少量蒸餾水，攪拌成糊狀，再加入蒸餾水配制至100 mL的黏膠液，溶脹24 h后用雙層紗布過濾即得。b組分：精密量取1.0 g b組分，加入少量1%醋酸溶液，攪拌成糊狀，再加1%醋酸溶液配制成100 mL的黏膠液，溶脹24 h，用雙層紗布過濾，即得，保存?zhèn)溆茫?］。

2.2 藥材的提取 稱取土茯苓藥材400 g，粉碎，按1∶10比例加入蒸餾水，置于90℃恒溫水浴中提取2 h，共提取3次，用紗布濾過，離心，上清液合并，減壓濃縮到料液比為1∶2（g/m L），即得土茯苓多糖粗提液，備用。

2.3 澄清劑優(yōu)化土茯苓多糖粗提液工藝步驟 量取相應(yīng)料液比的多糖溶液20 mL，于50 mL錐形瓶中，水浴加熱到試驗(yàn)溫度之后，首先加入b組分，攪勻，每30 min攪動(dòng)1次，按試驗(yàn)時(shí)間加入a組分，攪勻，每30min后攪動(dòng)1次。按試驗(yàn)時(shí)間后取出，定容，離心10min（4 000 r/min），傾出上清液。測(cè)定溶液中多糖與蛋白質(zhì)含有量，并算出其多糖保留率及蛋白去除率［7］。

2.4 多糖的測(cè)定

2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［8］精密稱量100.0 mg干燥至恒定質(zhì)量的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。由1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制質(zhì)量濃度梯度為500、250、125、62.5、31.25μg/ mL的葡萄糖溶液，分別精密吸取上述配制的500、250、125、62.5、31.25μg/m L的葡萄糖溶液2.0 mL于10 mL玻璃瓶中，然后加入6%苯酚溶液1.0 m L，搖勻，立即加濃硫酸5.0 mL，充分搖勻，室溫放置20 min，冷卻后于490 nm處測(cè)定吸光度，以水作為空白組，以葡萄糖質(zhì)量濃度 （C）為坐橫標(biāo)，吸光度 （A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.004 3C+0.041 3，r=0.995 2，表明葡萄糖在31.25～500 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 樣品多糖測(cè)定 取經(jīng)脫蛋白處理后的溶液和未處理的粗提液各1.0 mL，按照上述多糖測(cè)定方法，測(cè)定樣品中多糖的含有量并計(jì)算提取率。

2.5 蛋白質(zhì)的測(cè)定［9］

2.5.1 顯色劑配置 稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100.0 mg溶于50.0 mL 95%乙醇中，加入100.0 mL 85%磷酸，搖勻，加水稀釋至1 L，避光保存。

2.5.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密取牛血清白蛋白25.0 mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成牛血清白蛋白貯備液 （250 mg/L），吸取貯備液40.0 mL，置100 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得100mg/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分置10 mL試管中，各加水稀釋至1.0 mL，向各管中加入顯色劑 （考馬斯亮藍(lán)G-250溶液）5.0mL，混勻后，在30℃水浴中保溫5 min，用蒸餾水為空白，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度Y，以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度（X）作為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.003 5X+ 0.022 4，r=0.994 9，表明牛血清白蛋白在6.25～200 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.3 樣品蛋白測(cè)定 取經(jīng)脫蛋白處理之后的溶液和未經(jīng)處理的粗提液，按照上述蛋白質(zhì)的測(cè)定方法，測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含有量并計(jì)算出清除率。

2.6 影響因素和水平的確定［10-11］本實(shí)驗(yàn)分別考察澄清劑加入量，料液比，溫度，時(shí)間對(duì)Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑優(yōu)化土茯苓多糖工藝的影響。a、b組分體積比 （V/V）固定為1∶2，以澄清劑加入量 （mL），料液比 （g/mL），溫度 （℃），時(shí)間 （min）作為考察因素，每個(gè)因素分別設(shè)立5個(gè)水平 （n=6）。單因素試驗(yàn)影響因素和水平，見表1。

表1 單因素試驗(yàn)影響因素和水平

2.7 單因素試驗(yàn)

2.7.1 澄清劑加入量對(duì)Ⅱ型ZTC1+1澄清劑優(yōu)化土茯苓多糖工藝的影響 量取料液比為1∶10的多糖溶液5份，以溫度為70℃，時(shí)間為60 min，分別選取澄清劑b組分加入量為多糖溶液體積的2%、4%、6%、8%、10%，按照“2.4”項(xiàng)的方法，求出其多糖保留率及蛋白清除率，見圖1。

2.7.2 料液比對(duì)Ⅱ型ZTC1+1澄清劑優(yōu)化土茯苓多糖工藝的影響 分別量取料液比為1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12.5、1∶15的多糖溶液各1份，以溫度為70℃，時(shí)間為60 min，澄清劑b組分加入量為多糖溶液體積的6%。按照“2.4”項(xiàng)的方法，求出其多糖保留率及蛋白清除率，見圖2。

2.7.3 溫度對(duì)Ⅱ型ZTC1+1澄清劑優(yōu)化土茯苓多糖工藝的影響 量取料液比為1∶10的多糖溶液5份，以澄清劑b組分加入量為多糖溶液體積的6%，時(shí)間為60 min，分別在溫度為50、60、70、80、90℃的條件下水浴加熱。按照“2.4”項(xiàng)的方法，求出其多糖保留率及蛋白清除率，見圖3。

2.7.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Ⅱ型ZTC1+1澄清劑優(yōu)化土茯苓多糖工藝的影響 量取料液比為1∶10的多糖溶液5份，以澄清劑b組分加入量為多糖溶液體積的6%，溫度為70℃，a、b組分反應(yīng)時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min。按照“2.4”項(xiàng)的方法，求出其多糖保留率及蛋白清除率，見圖4。

圖1 澄清劑加入量對(duì)Ⅱ型ZTC1+1澄清劑優(yōu)化土茯苓多糖工藝的影響

圖2 料液比對(duì)Ⅱ型ZTC1+1澄清劑優(yōu)化土茯苓多糖工藝的影響

圖3 溫度對(duì)Ⅱ型ZTC1+1澄清劑優(yōu)化土茯苓多糖工藝的影響

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，各因素對(duì)Ⅱ型ZTC1+1澄清劑優(yōu)化土茯苓多糖工藝均有影響。隨著澄清劑加入量逐漸增加，多糖保留率先上升后緩慢下降，在b成分為4%，a成分為2%時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)；蛋白清除率具有一定波動(dòng)性升降，b成分在2%、4%、8%時(shí)清除率較高。隨著料液比的逐漸增加，藥液濃度逐漸降低，多糖保留率先基本保持不變，等到藥液濃度低到一定值后，即在料液比為1∶10之后，多糖保留率明顯上升；而蛋白清除率隨著料液比的逐漸增加先緩慢上升，在料液比為1∶10后沒有明顯變化。隨著溫度的逐漸升高，多糖保留率先上升后下降，在80℃時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)；蛋白清除率也是先上升后下降，在80℃時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。隨著時(shí)間的逐漸增加，多糖保留率增加先緩慢上升，在90min達(dá)到最高點(diǎn)，而后隨時(shí)間的增加，多糖保留率沒有明顯變化；蛋白清除率隨著時(shí)間的增加先下降，在60 min后沒有明顯的變化。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Ⅱ型ZTC1+1澄清劑優(yōu)化土茯苓多糖工藝的影響

2.8 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以澄清劑加入量、料液比、溫度、時(shí)間為考察因素，各選取最佳的3水平，以L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn) （n=6），具體見表2。按照“2.4”項(xiàng)的方法，求出其多糖保留率及蛋白清除率，并進(jìn)行方差分析。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平

2.8.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 見表3、表4、表5。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 多糖保留率方差分析

表5 蛋白清除率方差分析

由L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果 （見表3）的極差R可以看出，四因素對(duì)多糖保留率的影響順序?yàn)椋撼吻鍎緯r(shí)間＞溫度＞料液比；四因素對(duì)蛋白清除率的影響順序?yàn)椋撼吻鍎玖弦罕龋緯r(shí)間＞溫度。

從多糖保留率方差分析 （見表4）可以看出，澄清劑和時(shí)間兩因素對(duì)多糖保留率具有顯著性影響，其中澄清劑的影響最大，而料液比和溫度幾乎沒有影響。由蛋白清除率方差分析 （見表5）可以看出澄清劑對(duì)蛋白清除率具有顯著性的影響，而其他因素對(duì)其沒有顯著性的影響。

綜上所述，澄清劑和時(shí)間對(duì)多糖保留率具有顯著性影響，而澄清劑又對(duì)蛋白清除率有顯著影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，澄清劑b成分為2%時(shí)的多糖溶液澄清度好于為4%時(shí)，結(jié)合單因素結(jié)果和從節(jié)約成本方面，確定Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑純化土茯苓多糖的最佳工藝條件為澄清劑加入量b組分為2%，a組分為1%，料液比為1∶15，溫度為80℃，反應(yīng)時(shí)間120 min。

2.8.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 由正交試驗(yàn)結(jié)果得出的提取最佳工藝條件，按照 “2.4”項(xiàng)的方法，平行3次，求出其多糖保留率及蛋白清除率，結(jié)果見表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(%)

由表6可以看出，所得的多糖保留率最高，平均值為94.07%，大于正交試驗(yàn)結(jié)果，RSD為1.5%；同時(shí)蛋白清除率平均值為55.59%，RSD為2.4%，表明該優(yōu)化條件穩(wěn)定可行。與正交試驗(yàn)序列號(hào)1條件比較，1條件雖蛋白清除率高，達(dá)到61.71%的蛋白清除率，但多糖也損失了高達(dá)25.47%；驗(yàn)證試驗(yàn)條件的多糖保留率在高達(dá)94.07%的同時(shí)，蛋白清除率達(dá)到了55.59%，只比正交試驗(yàn)1條件少6.12%，相比之下，驗(yàn)證試驗(yàn)條件簡(jiǎn)單合理，穩(wěn)定可行。

2.9 對(duì)照試驗(yàn)

2.9.1 醇沉法除蛋白 量取料液比為1∶15的多糖溶液50.0mL于500 mL錐形瓶中，緩慢加入4倍量的無(wú)水乙醇，并不斷混勻，密封，放入4℃冷庫(kù)靜置24 h，傾出上清液，過濾，沉淀用50.0 mL熱水溶解后，過濾不溶物，定容至50 mL，即為醇沉后的多糖溶液。按照 “2.4”項(xiàng)的方法，求出其多糖保留率及蛋白清除率。結(jié)果顯示，醇沉法醇沉一次的多糖保留率平均為64.53%，蛋白清除率平均為63.27%。

2.9.2 Sevag法除蛋白［11］Sevag法試劑的配制：按4∶1的比例分別量取三氯甲烷80.0 mL和正丁醇20.0 mL，充分混勻，密閉保存。量取料液比為1∶15的多糖溶液50.0 mL，按5∶1的比例，加入Sevag試劑10.0 mL，進(jìn)行脫蛋白處理，充分振蕩30～40 min后，離心10 min（4 000 r/min），使分層，分別取上層水相，共脫蛋白6次，取水相定容至50 mL，即為Sevag法除蛋白后的多糖溶液。按照“2.4”項(xiàng)的方法，求出其多糖保留率及蛋白清除率。結(jié)果顯示，Sevag法萃取6次的多糖保留率平均為65.98%，蛋白清除率平均為62.8%。

由此可見，天然澄清劑最佳純化條件與醇沉法及Sevag法相比，蛋白清除率少了10%左右，但多糖保留率卻相對(duì)高了近30%，醇沉法及Sevag法在蛋白清除的同時(shí)，多糖損失十分嚴(yán)重。由此可知，天然澄清劑在純化多糖溶液方面比傳統(tǒng)的醇沉法及Sevag法更有優(yōu)勢(shì)，效果更明顯。

3 討論

因Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑純化土茯苓多糖工藝要求最大可能的保留溶液中的多糖成分，清除蛋白等雜質(zhì)成分，所以本實(shí)驗(yàn)以多糖保留率和蛋白清除率為指標(biāo)，是合理恰當(dāng)?shù)摹Ｔ诙嗵羌兓椒ㄖ?，傳統(tǒng)醇沉法要消耗大量乙醇試劑，且多糖損失也多，增加了成本。Sevag法除蛋白存在有機(jī)試劑殘留的毒性弊端，文獻(xiàn)報(bào)道Sevag法除蛋白后的多糖抗氧化活性弱于未除蛋白的粗多糖，推測(cè)Sevag法除蛋白可能破壞了多糖的結(jié)構(gòu)［12］。Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑在多糖保留方面更顯著，純化除渣效果也很明顯，且用量少，工序簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)效益好。本實(shí)驗(yàn)通過單因素及正交試驗(yàn)研究Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑純化土茯苓多糖的最佳工藝條件，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行，簡(jiǎn)單合理。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑對(duì)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白的吸光值有一定的干擾，而對(duì)多糖的吸光值測(cè)定幾乎沒有影響。筆者通過試驗(yàn)，即按照“2.5.2”項(xiàng)的方法，以空白組 （蒸餾水）和體積分?jǐn)?shù)分別為0.1% ～10%的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑溶液加入顯色劑 （考馬斯亮藍(lán)G-250溶液），并測(cè)定其吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入不同體積分?jǐn)?shù)的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑溶液之間的吸光度相差不大，且與其體積分?jǐn)?shù)無(wú)線性關(guān)系；與空白組相比，其吸光度均比空白組要高，高出的吸光度使得純化后的多糖溶液蛋白含有量測(cè)定吸光度偏高。這可能是Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑與考馬斯亮藍(lán)發(fā)生某種反應(yīng)，對(duì)蛋白吸光度測(cè)定產(chǎn)生一定干擾，使絮凝后溶液的蛋白測(cè)量值比實(shí)際值偏高。

在四因素三水平正交試驗(yàn)中，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)法得出方差分析的F值及P值。因上述試驗(yàn)所用正交表中無(wú)空白列作對(duì)照，所以可將離差平方和中最小的項(xiàng)來(lái)近似作為誤差的估計(jì)，用于計(jì)算各因子列的F值及P值［13］。本實(shí)驗(yàn)中，多糖保留率方差分析中離差平方和最小的因素是溫度，為0.001，故把溫度設(shè)為誤差，進(jìn)行方差分析，默認(rèn)溫度對(duì)多糖保留率的影響最??；同樣，蛋白清除率方差分析中平方和最小的因素是時(shí)間，為0.05，故把時(shí)間設(shè)為誤差，進(jìn)行方差分析，默認(rèn)時(shí)間對(duì)多糖保留率的影響最小。

綜上所述，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑純化土茯苓多糖的最佳工藝條件，能最大可能保留多糖成分的同時(shí)除去更多的蛋白等雜質(zhì)，安全穩(wěn)定，對(duì)土茯苓多糖的純化及深入研究和開發(fā)利用具有十分重要的意義。

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R284.2

：B

：1001-1528（2015）07-1605-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.050

2014-04-12

廣東省科技廳省部產(chǎn)學(xué)研合作專項(xiàng)資金 （2011A09000020、2013B090700015）；廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（S201303001515）；廣東省中醫(yī)院中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項(xiàng)項(xiàng)目 （YK2013B1N02）

陳文良 （1975—），男，碩士，主管中藥師，從事中藥質(zhì)量控制相關(guān)技術(shù)研究。Tel：13631323638，E-mail：chenwenliang2014@163.com

*通信作者：朱 偉 （1975—），男，博士，研究員，從事中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel：（020）39318571，E-mail：zhuwei9201@ 163.com