李鳳華， 劉春娜， 劉新宇， 宋斐然， 姚紅月， 鄭久明， 楊 菁

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州121001；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110013）

洋地黃雙苷眼用凝膠對(duì)大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變中細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的影響

李鳳華1，2， 劉春娜1*， 劉新宇2， 宋斐然3， 姚紅月2， 鄭久明1， 楊 菁1

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州121001；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110013）

目的本研究在大鼠糖尿病的基礎(chǔ)上制備視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）模型，觀察洋地黃雙苷眼用凝膠對(duì)DR的保護(hù)作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。方法取100只SD大鼠，尾靜脈注射鏈脲佐菌素 （STZ）100mg/kg，四氧嘧啶100 mg/kg，3 d后誘發(fā)糖尿病，3個(gè)月后造成視網(wǎng)膜病變模型。模型大鼠分為5組，用不同質(zhì)量濃度的洋地黃雙苷眼用凝膠（0.1、0.3、0.5 mg/mL，早、午、晚各點(diǎn)眼1次），ELISA法測(cè)定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （bFGF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白介素-6（IL-6）的水平，另取視網(wǎng)膜進(jìn)行鋪片，觀察DR血管病理變化。結(jié)果視網(wǎng)膜病變動(dòng)物一般狀態(tài)較差，血糖、尿糖均升高，體質(zhì)量下降，模型組VEGF、bFGF、IL-6和TNF-α水平均增加，與空白組比較，均具有顯著性差異 （P＜0.05）。給予不同質(zhì)量濃度的洋地黃雙苷眼用凝膠后，以上4個(gè)指標(biāo)水平均降低，與模型組比較，均具有顯著性差異 （P＜0.05）。另外，給藥組視網(wǎng)膜微血管病變明顯改善，白內(nèi)障及失明率顯著下降。結(jié)論洋地黃雙苷眼用凝膠通過(guò)降低炎癥介質(zhì) （IL-6和TNF-α）及細(xì)胞因子（VEGF和bFGF）水平，對(duì)DR具有治療作用。

洋地黃苷；七葉亭苷；糖尿病視網(wǎng)膜病變；細(xì)胞因子；炎癥因子；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

目前，糖尿?。╠iabetesmellitus）的發(fā)病率逐年上升，在我國(guó)已有近9460萬(wàn)的糖尿病患者，而糖尿病最為常見(jiàn)和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥是視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy， DR），其發(fā)病率高達(dá)70%以上。視網(wǎng)膜病變的主要標(biāo)志為新生血管生成，是糖尿病代謝紊亂和內(nèi)分泌系統(tǒng)損害在微血管中的最主要表現(xiàn)［1-2］。盡管視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制尚不明確，但研究表明其與視網(wǎng)膜缺氧及缺血關(guān)系密切，視網(wǎng)膜在缺氧情況下會(huì)釋放出多種炎性細(xì)胞因子，可刺激新生血管形成。視網(wǎng)膜病變?cè)缙诓±砀淖優(yōu)槊?xì)血管周細(xì)胞選擇性喪失，形成微血管瘤，之后基底膜逐漸增厚，導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織中的滲漏性、閉塞性和增殖性微血管病變及血管周?chē)w維組織增生，出現(xiàn)新生血管異常，引起玻璃體出血甚至視網(wǎng)膜剝離［3-4］，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變患者失明。

目前治療視網(wǎng)膜病變的方法主要有中藥、中西醫(yī)結(jié)合、針灸及手術(shù)等，但療效均不甚理想。少數(shù)報(bào)道表明，洋地黃雙苷眼用凝膠作用平和，局部用藥不良反應(yīng)較少，具有免疫抑制、抗炎等多種藥理作用［5］。洋地黃雙苷眼用凝膠是洋地黃葉干提物及七葉亭苷組成的復(fù)方制劑，主要成分為洋地黃苷和七葉亭苷，這兩種血管活性成分能明顯改善視網(wǎng)膜的微循環(huán)血供，并選擇性作用于脈絡(luò)膜，還可通過(guò)加強(qiáng)抗氧化應(yīng)激來(lái)增加其血流量［6-7］。為進(jìn)一步闡明洋地黃雙苷眼用凝膠的療效，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了視網(wǎng)膜病變的藥效學(xué)及機(jī)制研究，為臨床治療提供有效藥物。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠120只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半。動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（遼）2003-0007。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 洋地黃葉干提物 （主要成分為七葉亭苷，白色針狀結(jié)晶，無(wú)氣味，味苦，分子式 C15H16O9，分子質(zhì)量340.28，純度98%以上，遼寧醫(yī)學(xué)院新藥研究所）。低劑量洋地黃雙苷眼用凝膠為每10 mL含洋地黃葉干提物0.5 mg，秦皮甲素1.0mg；中劑量為每10 mL含干提物1.5 mg，秦皮甲素3.0 mg；高劑量為每10 mL含干提物2.5 mg，秦皮甲素5.0mg；空白基質(zhì)。

1.3 分組 將SD大鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組、視網(wǎng)膜病變模型組、洋地黃雙苷眼用凝膠低、中、高質(zhì)量濃度藥物實(shí)驗(yàn)組，每組20只糖尿病大鼠。

2 方法

2.1 大鼠糖尿病模型的造模方法［6］上述動(dòng)物均先適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，除空白對(duì)照大鼠外，其余各組動(dòng)物尾靜脈注射鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ） （溶于新鮮配制的0.1 mol/L，pH 4.3的檸檬酸鈉緩沖液中）和四氧嘧啶各100 mg/kg，連續(xù)給藥3 d，用于誘發(fā)糖尿病。另取20只空白對(duì)照組大鼠，腹腔注射相同體積的檸檬酸鈉緩沖液。3 d后檢測(cè)大鼠的血糖及尿糖，以空腹血糖超過(guò)16.5 mmol/L，尿糖++++以上，尿量及飲水明顯增多的受試大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，每周檢測(cè)其尿糖、血糖以及體質(zhì)量變化。糖尿病大鼠成模12周后，排除死亡和血糖恢復(fù)者，取其中80只作為視網(wǎng)膜病變模型，按上述分組情況用空白基質(zhì)、低、中、高課題洋地黃雙苷眼用凝膠（0.1、0.3、0.5 mg/mL）點(diǎn)眼，每天早、午、晚各點(diǎn)眼1次，每次藥物在眼內(nèi)停留60 s以上，不溢出，連續(xù)給藥4周。

2.2 指標(biāo)測(cè)定

2.2.1 觀察一般狀態(tài)、給藥局部及尿糖、血糖變化 視網(wǎng)膜病變?cè)炷Ｇ昂蠹敖o藥期間均不禁食，術(shù)后任其自由活動(dòng)，給予充足的水分及食物，并觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)以及藥物點(diǎn)眼局部癥狀，關(guān)注是否有出血或白內(nèi)障等癥狀出現(xiàn)，并且每周進(jìn)行眼底鏡檢查。排除死亡和血糖恢復(fù)者，各組大鼠在給藥后4周均隨機(jī)選取10只作為受試對(duì)象，代謝籠收集其當(dāng)日尿量，進(jìn)行尿量測(cè)定和尿常規(guī)檢測(cè)。剩余10只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用20%烏拉坦 （1 g/kg）麻醉后頸動(dòng)脈插管，負(fù)壓抽血管取血2 mL，用于大鼠血糖等指標(biāo)測(cè)定。

2.2.2 VEGF、SDF及炎癥介質(zhì)等的測(cè)定［6］藥物點(diǎn)眼后4周，上述動(dòng)物用烏拉坦麻醉后迅速摘除眼球，切開(kāi)眼前節(jié)，沿鋸齒緣環(huán)形剪開(kāi)，以視神經(jīng)為中心取帶有視網(wǎng)膜的眼球后部，加生理鹽水0.9 mL制備10%組織勻漿，冷凍離心（3 500 r/min，15 min）后取上清液，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）測(cè)定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （bFGF）、白介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平。

2.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)以用x±s表示；率的比較用卡方檢驗(yàn)；組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)關(guān)系采用直線相關(guān)分析。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性意義，P＜0.01認(rèn)為差異有非常顯著性意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài) 所有糖尿病模型大鼠成模2周后，開(kāi)始出現(xiàn)多飲、多食、多尿等典型的視網(wǎng)膜病變癥狀，隨著病程延長(zhǎng)，其體質(zhì)量增長(zhǎng)開(kāi)始減緩，甚至上下波動(dòng)。與空白對(duì)照組大鼠相比，模型組及實(shí)驗(yàn)組明顯消瘦，并伴有活動(dòng)減少、行動(dòng)遲緩、懶惰、無(wú)進(jìn)攻性、易感染。每組糖尿病模型大鼠在造模后3個(gè)月及給藥1個(gè)月期間均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡率30%～40%，排除死亡和血糖恢復(fù)者，各組在給藥后4周均隨機(jī)選取10只作為受試對(duì)象。在模型組中，大部分視網(wǎng)膜病變大鼠開(kāi)始出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的白內(nèi)障，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重，部分失明。進(jìn)行眼底鏡檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)，給予不同課題洋地黃雙苷眼用凝膠的動(dòng)物眼底出血及白內(nèi)障等癥狀明顯改善，未見(jiàn)失明，見(jiàn)表1。3.2 血糖、尿糖及體質(zhì)量變化 正常對(duì)照大鼠的血糖在3～6 mmol/L之間，且尿糖均為陰性，而糖尿病大鼠成模后血糖均在16.5 mmol/L以上，明顯高于正常大鼠（P＜0.01），同時(shí)它們24 h的尿量也多于正常大鼠，尿糖均大于+++，持續(xù)2周以上。給藥后4周，糖尿病大鼠體質(zhì)量明顯低于空白對(duì)照組 （P＜0.01）。受試藥物組與糖尿病視網(wǎng)膜模型組在血糖、尿糖等方面無(wú)顯著性差異 （P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 洋地黃雙苷眼用凝膠對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變影響 [動(dòng)物數(shù) (%)]

表2 糖尿病模型大鼠血糖、尿糖及體質(zhì)量的變化 (x±s,n=10)

3.3 對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的改變 ELISA法測(cè)定各組實(shí)驗(yàn)大鼠VEGF、bFGF、IL-6及TNF-α水平，發(fā)現(xiàn)不同劑量洋地黃雙苷眼用凝膠均能明顯降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF、bFGF、IL-6及TNF-α的表達(dá)，與糖尿病模型組相比，具有顯著性差異 （P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 洋地黃雙苷眼凝膠對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠VEGF,bFGF,IL-6和TNF-α的影響(x±s,n=10)

4 討論

目前，我國(guó)糖尿病發(fā)病率世界第一，而視網(wǎng)膜病變是糖尿病最為常見(jiàn)和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，其發(fā)生機(jī)制與氧化應(yīng)激、老齡化、炎性反應(yīng)及新生血管化等有關(guān)［8-9］。當(dāng)視網(wǎng)膜病變發(fā)生時(shí)，血管通透性增加，血-視網(wǎng)膜屏障受損，促進(jìn)VEGF釋放。VEGF是最強(qiáng)的血管生成因子和內(nèi)皮細(xì)胞選擇性促有絲分裂因子，而bFGF是活性很強(qiáng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞促增殖劑和血管生成因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管生成的作用，兩者參與了多種生理和病理性新生血管形成過(guò)程。視網(wǎng)膜病變患者由于視網(wǎng)膜缺血缺氧，眼內(nèi)VEGF、bFGF大量產(chǎn)生，與高親和力受體結(jié)合而介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致新生血管形成［10-11］。

洋地黃雙苷眼用凝膠是洋地黃葉干提物及七葉亭苷組成的復(fù)方制劑，主要成分為洋地黃苷和七葉苷。研究發(fā)現(xiàn)［12］，七葉苷主要成分為秦皮甲素和秦皮乙素，對(duì)黃斑變性等多種眼底病變有保護(hù)及治療作用，同時(shí)具有非特異性抗炎作用。洋地黃雙苷可通過(guò)減少毛細(xì)血管阻力，緩解血管痙攣，維持脈絡(luò)膜的舒縮功能并增加其血流，改善DR眼底微循環(huán)，促進(jìn)缺血組織迅速恢復(fù)，防止視網(wǎng)膜色素細(xì)胞萎縮，從而保護(hù)視網(wǎng)膜，可用于眼底黃斑變性和視網(wǎng)膜相關(guān)疾病的治療。洋地黃雙苷的血管活性成份能改善視網(wǎng)膜的微循環(huán)，使受損的上皮色素細(xì)胞及視神經(jīng)細(xì)胞的功能得到恢復(fù)［13-15］。另有研究表明［15-16］，洋地黃雙苷可降低線粒體膜電位，抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，也可能是其治療DR的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洋地黃雙苷眼用凝膠局部點(diǎn)眼時(shí)，對(duì)一般狀態(tài)等無(wú)影響，但能明顯改善視網(wǎng)膜病變大鼠的眼底病理改變，減少出血、白內(nèi)障及失明的發(fā)病率，使視網(wǎng)膜微血管病變得到明顯的保護(hù)或延緩。另外還進(jìn)一步證明，DR大鼠眼組織中VEGF及bFGF表達(dá)增加，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定病變眼組織中VEGF及bFGF變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，兩者明顯增加，而且有顯著性差異 （P＜0.01），提示它們不僅能介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致新生血管形成，而且在DR早期病變過(guò)程中也發(fā)揮重要的作用。洋地黃雙苷可通過(guò)降低bFGF表達(dá)，抑制纖維增生及毛細(xì)血管基底膜增厚，對(duì)大鼠視網(wǎng)膜病變具有一定防治作用。同時(shí)實(shí)驗(yàn)顯示，洋地黃雙苷眼用凝膠可能是通過(guò)抑制VEGF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞病理性增殖，達(dá)到既改善視網(wǎng)膜的缺氧狀態(tài)，又促進(jìn)新生血管的消退，從而抑制視網(wǎng)膜病變的發(fā)生及發(fā)展。

另外，視網(wǎng)膜病變大鼠眼組織中由于血管通透性增高，多種炎性介質(zhì)滲出及生成增多，可能會(huì)進(jìn)一步加速視網(wǎng)膜病變的發(fā)生及發(fā)展。而給予洋地黃雙苷眼用凝膠后，大鼠IL-6和TNF-α水平明顯降低，具有顯著性差異 （P＜0.01）。因此，它能降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中炎性因子的表達(dá)，對(duì)治療視網(wǎng)膜病變效果明顯，推測(cè)可能是通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)生成和VEGF及bFGF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮保護(hù)及治療作用。

［1］宋 鄂，董 宇，石 博，等.STZ糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變模型的評(píng)價(jià)［J］.眼科研究，2004，22（2）：124-127.

［2］夏玲玲，魏 偉，林 輝，等.燈盞花素對(duì)糖尿病大鼠肝臟保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004，20（6）：664-667.

［3］Heidary G，Vanderveen D，Smith L E.Retinopathy of prematurity：current concepts in molecular pathogenesis［J］.Semin Ophthalmol，2009，24（2）：77-81.

［4］曲榮梅，王 磊，姬淑彥.施圖倫滴眼劑在視網(wǎng)膜病的應(yīng)用［J］.中華臨床醫(yī)藥與護(hù)理，2005，3（9）：39-40.

［5］相萍萍，王 旭.中醫(yī)藥治療糖尿病視網(wǎng)膜病變研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（3）：813-815.

［6］龐東渤，符麗娟，劉學(xué)政.鏈脲佐菌素-糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管病理改變［J］.眼視光學(xué)雜志，2005，7（1）：47-49.

［7］張廣棟，劉學(xué)政，張 鵬，等.大鼠視網(wǎng)膜光損傷MDA含量和形態(tài)學(xué)改變及SOD的治療作用［J］.錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27（2）：16-18.

［8］鄭建秋，郭 慶，騰 巖.糖尿病大鼠視網(wǎng)膜早期病變組織中生長(zhǎng)因子作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)用眼科雜志，2001，19（7）：495-498.

［9］Penn JS，Madan A，Caldwell R B，et al.Vascular endothelial growth factor in eye disease［J］.Prog Retin Fye Res，2008，27（4）：331-371.

［10］Abdallah W，F(xiàn)awzi A A.Anti-VEGF therapy in proliferative diabetic retinopathy［J］.Int Ophthalmol Clin，2009，49（2）：95-107.

［11］朱永紅，顧振綸，周文軒，等.中藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病視網(wǎng)膜病變作用的研究進(jìn)展［J］.中成藥，2008，30（7）：1033-1035.

［12］張?zhí)K陽(yáng)，陳佳正，李曉英，等.平藏藥八味秦皮丸中秦皮甲素、秦皮乙素和麝香酮的定量測(cè)定［J］.中成藥，2011，33（6）：984-988.

［13］Cury CE Jr，Rodrigues E B，Meyer C H，et al.VEGF inhibitors and vitrectomy for diabetic vitreoretinopathy［J］.Dev Ophthalmol，2009，44（3）：69-81.

［14］吳元潔，鄭書(shū)國(guó)，方朝暉，等.糖尿病大鼠血糖波動(dòng)下SOD、MDA、NO變化及丹蛭降糖膠囊的干預(yù)作用［J］.中成藥，2014，35（7）：1061-1366.

［15］呂 明，張 蕊.全視網(wǎng)膜光凝聯(lián)合復(fù)方樟柳堿治療糖尿病視網(wǎng)膜病變［J］.國(guó)際眼科雜志，2014，14（4）：692-694.

［16］王 晶.秦皮甲素對(duì)肺癌小鼠抑瘤作用的研究［J］.中成藥，2014，36（2）：249-252.

［17］江 婷，方朝暉，凌含鵬，等.糖尿病視網(wǎng)膜病變的中醫(yī)藥防治［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2014，26（3）：324-326.

R966

：B

：1001-1528（2015）07-1570-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.039

2014-07-16

國(guó)家自然基金項(xiàng)目 （81201037）；遼寧省人事廳百千萬(wàn)人才資助項(xiàng)目 （2012921020）；遼寧省科技廳科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（2010225034）；遼寧醫(yī)學(xué)院校長(zhǎng)基金項(xiàng)目 （2010225034）

李鳳華 （1978—），女，碩士，主治醫(yī)師，從事內(nèi)分泌中藥藥理工作。

*通信作者：劉春娜（1977—），女，博士，副教授，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。Tel：（0416）4673465，E-mail：springnanaliu@163.com