朱冬可， 吳佩穎，*， 高 崎， 顧慧芬，

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203；2.上海杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海201703）

乳腺消郁顆粒的質(zhì)量控制

朱冬可1， 吳佩穎1，2*， 高 崎2， 顧慧芬2，

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203；2.上海杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海201703）

目的建立乳腺消郁顆粒的質(zhì)量控制方法。方法采用HPLC法測(cè)定乳腺消郁顆粒中芍藥苷和松果菊苷含有量，同時(shí)對(duì)其中的川芎、當(dāng)歸、淫羊藿、鎖陽藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別。結(jié)果HPLC法測(cè)出芍藥苷和松果菊苷分別在31.55～631mg/L（r=0.999 9）和9.95～298.5mg/L（r=0.999 9）范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為100.09%（RSD=0.71%）和100.59%（RSD=1.14%）。同時(shí)，薄層色譜中檢出了川芎、當(dāng)歸、淫羊藿、鎖陽的特征斑點(diǎn)。結(jié)論該方法重復(fù)性好、簡(jiǎn)便、快速，能夠有效控制乳腺消郁顆粒的質(zhì)量。

乳腺消郁顆粒；HPLC法；薄層色譜法；質(zhì)量控制

乳腺小葉增生在中醫(yī)上屬于 “乳癖”范疇，產(chǎn)生因素有很多。中醫(yī)理論認(rèn)為，肝腎同源，肝藏血，腎藏精，肝疏泄功能失常，氣機(jī)失調(diào)，以及腎的先天和后天之精不足，發(fā)育不良，最終導(dǎo)致乳腺小葉增生［1］?，F(xiàn)代研究表明，情志內(nèi)傷、沖任失調(diào)、勞累過度或體內(nèi)雌激素分泌失調(diào)等都可能引發(fā)該?。?-3］。傳統(tǒng)中醫(yī)主要以疏肝解郁、行氣化痰、調(diào)理沖任、活血通絡(luò)、消癥散結(jié)為治療方法［2］。乳腺消郁顆粒是上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院的醫(yī)院制劑，對(duì)治療女性乳房疾病有很好的療效，主要功能為疏肝消郁，調(diào)攝沖任，用于治療乳房脹痛和小葉增生，由赤芍、肉蓯蓉、川芎、當(dāng)歸、淫羊藿、鎖陽等12味藥組成。赤芍和肉蓯蓉散瘀止痛，溫補(bǔ)腎陽，起主要作用；川芎和當(dāng)歸活血行氣，調(diào)經(jīng)止痛，淫羊藿和鎖陽溫補(bǔ)腎陽，起輔佐作用。但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)以定性鑒別為主，無定量測(cè)定，專屬性不強(qiáng)。為了更有效控制乳腺消郁顆粒的質(zhì)量及療效，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定其中赤芍所含的芍藥苷及肉蓯蓉所含的松果菊苷含有量，并應(yīng)用薄層色譜法對(duì)其中川芎、當(dāng)歸、淫羊藿、鎖陽藥材進(jìn)行鑒別，以期提高乳腺消郁顆粒質(zhì)量控制方法，保證臨床療效。

1 儀器和試藥

Waters1525-2487高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；DC-200H超聲波清洗儀 （東莞市塘廈昆圣超聲波機(jī)械加工廠）；BS 110S電子天平 （北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。乳腺消郁顆粒 （上海杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為130801、130802、130803）；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736-201337）、松果菊苷 （批號(hào)111670-200503）、熊果酸 （批號(hào)111742-200517）、淫羊藿苷 （批號(hào)1110737-200312），川芎對(duì)照藥 （批號(hào)120918-201110）、當(dāng)歸 （批號(hào)120927-201014）、淫羊藿 （批號(hào)121032-200501），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙酸乙酯、乙醚、甲苯、丁酮、甲酸、正己烷均為分析純 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲醇為色譜純 （德國(guó)Merck公司）。

2 薄層色譜鑒別

2.1 川芎、當(dāng)歸藥材薄層色譜鑒別 取本品3批和缺川芎、當(dāng)歸藥材的陰性樣品各2包 （約24 g），加水200 mL溶解，乙醚萃取3次，每次150 mL，合并萃取液，濃縮蒸干，殘?jiān)右颐?mL溶解，作為供試品溶液和陰性樣品溶液；取川芎0.1 g，當(dāng)歸0.1 g，分別加乙醚15 mL溶解，超聲處理20 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右颐? m L溶解，作為對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法 （《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VIB），吸取供試品溶液和陰性樣品溶液10μL以及對(duì)照品溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯 （4∶1）為展開劑［4］展開，取出后晾干，置紫外光燈 （365 nm）下檢視。結(jié)果表明，在相應(yīng)的位置上，供試品色譜在與對(duì)照藥材顯示出相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性樣品無干擾，見圖1。

2.2 淫羊藿藥材薄層色譜鑒別 取本品3批和缺淫羊藿藥材陰性樣品各2包 （約24 g），充分研磨，加乙醇240 mL，50℃水浴溫浸30 min，濾過，蒸干，加乙醇3 mL溶解，作為供試品溶液和陰性樣品溶液；取淫羊藿藥材粉末0.1 g，加乙醇10 mL溶解，50℃水浴溫浸30 min，濾過，蒸干，加乙醇3 mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液；精密稱取淫羊藿苷5mg，置于50mL量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法 （《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VIB），吸取10μL供試品溶液和陰性樣品溶液、20μL對(duì)照藥材溶液、20μL對(duì)照品溶液，分別點(diǎn)于硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水 （10∶1∶1∶1）為展開劑展開［4］，置紫外燈 （365 nm）下檢視。結(jié)果表明，在相應(yīng)的位置上，供試品色譜與對(duì)照品顯示出相同的暗紅色斑點(diǎn)，然后噴以三氯化鋁試液再進(jìn)行檢視，結(jié)果顯示出相同的橙紅色熒光斑點(diǎn)，且陰性樣品無干擾，見圖2。

圖1 當(dāng)歸、川芎藥材的TLC

圖2 淫羊藿藥材的TLC

2.3 鎖陽藥材薄層色譜鑒別 取本品3批和缺鎖陽藥材陰性樣品各2包 （約24 g），充分研磨，加乙酸乙酯240 mL溶解，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，加乙酸乙酯3 mL溶解，作為供試品溶液和陰性樣品溶液；精密稱取熊果酸對(duì)照品5 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法 （《中國(guó)藥典》2010年版，一部附錄VIB），吸取20μL供試品溶液和陰性樣品溶液、10μL對(duì)照品溶液，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）為展開劑展開［4］，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至顯紫紅色斑點(diǎn)。結(jié)果表明，在相應(yīng)的位置上，供試品色譜與對(duì)照品顯示出相同的紫紅色斑點(diǎn)，且陰性樣品無干擾，見圖3。

3 兩種成分的HPLC測(cè)定

3.1 芍藥苷測(cè)定

圖3 鎖陽藥材的TLC

3.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取芍藥苷對(duì)照品12.62 mg，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度線，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.631 mg/mL的芍藥苷對(duì)照品溶液。3.1.2 供試品溶液和陰性樣品溶液的配制 取本品粉末和缺赤芍藥材陰性對(duì)照各1 g，置于具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL溶解，稱定質(zhì)量，超聲20min，放冷后用甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，再用0.45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液和缺赤芍陰性對(duì)照溶液。

3.1.3 色譜條件［4-5］Alltima C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），柱溫35℃，體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。以甲醇-0.05%醋酸 （23∶77）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

3.1.4 專屬性試驗(yàn) 取陰性樣品溶液，按照 “3.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺赤芍藥材樣品在相應(yīng)出峰時(shí)間處沒有出峰，說明該方法專屬性良好，見圖4。

3.1.5 線性關(guān)系的考察 分別精密量取 “3.1.1”項(xiàng)下芍藥苷對(duì)照品溶液0.25、0.5、1、2、3、4、5mL，置于5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度線，搖勻，得到不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按照 “3.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。繪制芍藥苷質(zhì)量濃度 （X）和峰面積 （Y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y=1.321×107X-18 807，r= 0.999 9。結(jié)果表明，芍藥苷在31.55～631 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.6 精密度試驗(yàn) 按 “3.1.3”項(xiàng)下色譜條件，精密稱取批號(hào)為130801樣品1份，按 “3.1.2”項(xiàng)方法制備成供試液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定芍藥苷峰面積，RSD為0.16%，表明精密度良好。

3.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為130801樣品6份，按 “3.1.2”項(xiàng)方法制備成供試液，按 “3.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定芍藥苷量。結(jié)果測(cè)得平均值為2.228 mg/g，RSD為1.07% （n=6），表明重復(fù)性良好。

3.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為130801樣品1份，按 “3.1.2”項(xiàng)方法制備成供試液，在常溫下放置24 h，按“3.1.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，測(cè)定芍藥苷峰面積，RSD為0.28%，表明供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖4 芍藥苷對(duì)照品 （A）、供試品 （B）與陰性樣品（C）HLPC色譜圖

3.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為130801的乳腺消郁顆粒各6份，每份1 g，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.409 mg/m L的芍藥苷對(duì)照品溶液5 mL，按“3.1.2”項(xiàng)方法操作，即得待測(cè)溶液。按 “3.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 乳腺消郁顆粒中芍藥苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.1.10 樣品測(cè)定 取3批樣品，按 “3.1.2”項(xiàng)下方法操作，供試品溶液按 “3.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定乳腺消郁顆粒中芍藥苷，結(jié)果見表2。

3.2 松果菊苷測(cè)定

3.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取松果菊苷對(duì)照品9.95 mg，置于20mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解，稀釋至刻度線，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.497 5 mg/mL的松果菊苷對(duì)照品溶液。

表2 乳腺消郁顆粒樣品中芍藥苷測(cè)定結(jié)果

3.2.2 供試品溶液和陰性樣品溶液的配制 取本品粉末和缺肉蓯蓉藥材陰性對(duì)照品各1 g，置于具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL溶解，稱定質(zhì)量，超聲40 m in，放冷后用50%甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，再用0.45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液和缺肉蓯蓉陰性對(duì)照溶液。

3.2.3 色譜條件［4］Alltima C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），柱溫35℃，體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。以甲醇-0.1%甲酸 （29∶71）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm。

3.2.4 專屬性試驗(yàn) 取陰性樣品溶液，按照 “3.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺肉蓯蓉藥材樣品在相應(yīng)出峰時(shí)間處沒有出峰，說明該方法專屬性良好，見圖5。

圖5 松果菊苷對(duì)照品 （D）、供試品 （E）與陰性樣品（F）HLPC色譜圖

3.2.5 線性關(guān)系的考察 分別精密量取 “3.2.1”項(xiàng)下松果菊苷照品溶液0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，置于5mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度線，搖勻，得到不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按照 “3.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。繪制松果菊苷質(zhì)量濃度 （X）和峰面積 （Y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y=1.316×107X-5 763.8，r=0.999 9，表明松果菊苷在9.95～298.5 mg/L范圍內(nèi)線性良好。

3.2.6 精密度試驗(yàn) 按 “3.2.3”項(xiàng)下色譜條件，精密稱取批號(hào)為130801樣品1份，按 “3.2.2”項(xiàng)制備成供試液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得松果菊苷峰面積，RSD為0.97%，表明精密度良好。

3.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為130801樣品6份，按 “3.2.2”項(xiàng)制備成供試液，按 “3.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定松果菊苷量。結(jié)果測(cè)得平均值為4.472 mg/g，RSD為0.43%（n=6），表明重復(fù)性良好。

3.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為130801樣品1份，按 “3.2.2”項(xiàng)制備成供試液，在常溫下放置24 h，按“3.2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，測(cè)得松果菊苷峰面積，RSD為1.36%，表明供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為130801的乳腺消郁顆粒各6份，每份1 g，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.607 6 mg/mL的松果菊苷對(duì)照品溶液7.5 mL，按“3.2.2”項(xiàng)方法操作，即得待測(cè)溶液。按 “3.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 乳腺消郁顆粒中松果菊苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.2.10 樣品測(cè)定 取3批樣品，按 “3.2.2”項(xiàng)下方法操作，供試品溶液按 “3.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定乳腺消郁顆粒中松果菊苷，結(jié)果見表4。

表4 乳腺消郁顆粒樣品中松果菊苷測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論及討論

赤芍為毛茛科多年生草本植物芍藥或川赤芍的根，具有清熱涼血，散瘀止痛之功效。有資料表明［6］，大劑量赤芍對(duì)治療急性乳腺炎有很好的療效。芍藥苷是芍藥中的主要有效成分之一，是一種單萜類糖苷化合物。近年來，研究人員對(duì)其展開了一系列深入的研究，發(fā)現(xiàn)它具有多種藥理作用，且毒副作用小。殷天照等報(bào)道［7］，在中藥配伍中如果芍藥苷煎出量高，則治療乳腺增生效果較好。 《本草匯言》中記述，肉蓯蓉是 “養(yǎng)命門，滋腎氣，補(bǔ)精血之藥也。婦人沖任失調(diào)而陰氣不治，此乃平補(bǔ)之劑……”?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)［8］，肉蓯蓉中含有雄性激素樣作用活性成分，可以調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平［9］。另外，松果菊苷在 《中國(guó)藥典》2010年版中作為控制肉蓯蓉質(zhì)量的有效成分。因此，把芍藥苷和松果菊苷作為本實(shí)驗(yàn)中的活性成分測(cè)定指標(biāo)來進(jìn)行研究更具代表性，能夠更好地控制藥物的療效。

芍藥苷的前處理實(shí)驗(yàn)比較了以甲醇、90%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇為溶劑，進(jìn)行超聲提取。結(jié)果表明，采用甲醇為提取溶劑時(shí)，提取完全，操作方便，檢測(cè)時(shí)雜質(zhì)峰少。同時(shí)，還以甲醇為提取溶劑，分別超聲20、30、40 min，檢測(cè)同一批號(hào)中芍藥苷含有量，發(fā)現(xiàn)超聲20 min時(shí)，不但所需時(shí)間短，而且提取完全。

芍藥苷的分離試驗(yàn)中，根據(jù)文獻(xiàn)［4-5，10-12］報(bào)道，分別采用甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，同時(shí)結(jié)合生產(chǎn)檢測(cè)需要，選擇成本低、效率高、分離效果好的流動(dòng)相。結(jié)果表明，甲醇-0.05%醋酸峰型和分離度理想，經(jīng)優(yōu)化后最終確定流動(dòng)相為甲醇-0.05%醋酸 （23∶77）。

松果菊苷的分離試驗(yàn)中，采用甲醇-0.1%甲酸 （29∶71）等度洗脫，不僅出峰時(shí)間短，效率高，而且分離效果好。

薄層色譜鑒別中，對(duì)起主要療效的有效成分當(dāng)歸、川芎、淫羊藿、鎖陽進(jìn)行了薄層色譜鑒別。結(jié)果表明，色譜斑點(diǎn)清晰，方法重復(fù)性好，而且陰性對(duì)照無干擾。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)方法可以作為乳腺消郁顆粒清膏、半成品、顆粒的質(zhì)量控制手段，能夠有效控制其在生產(chǎn)過程中的質(zhì)量，并且操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好。

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R927.1

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：1001-1528（2015）06-1375-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.051

2014-09-11

朱冬可（1989—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幹扑幮录夹g(shù)研究。E-mail：zhudongke.123@163.com

*通信作者：吳佩穎（1961—），男，教授，研究方向?yàn)橹兴幹扑幮录夹g(shù)研究及其產(chǎn)業(yè)化。E-mail：wupeiyingsh@163.com