韓 斌， 王志義

（1.遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州121000；2.錦州石化醫(yī)院，遼寧錦州121000）

燙傷膏對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)作用及機制

韓 斌1， 王志義2

（1.遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州121000；2.錦州石化醫(yī)院，遼寧錦州121000）

目的研究燙傷膏對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的修復(fù)作用及作用機制。方法100只SD大鼠隨機分為空白對照組，模型組，陽性對照組，燙傷膏劑組。對75只大鼠 （模型組，陽性對照組，燙傷膏劑組）背部造成深Ⅱ度燙傷，燙傷后立即給藥，每日換藥2次。每日肉眼觀察創(chuàng)面瘀血水腫、痂下積膿，肉芽組織增生情況，定期測量創(chuàng)面愈合面積，計算創(chuàng)傷愈合率。分別于燙傷后7、10、14、21 d取材做病理切片以及表皮細胞生長因子 （EGF），堿性成纖維細胞生長因子 （bFGF）免疫組化切片。燙傷后48 h測量血清白細胞介素-1β（IL-1β）水平。結(jié)果燙傷膏劑組和陽性對照組的創(chuàng)傷愈合率明顯高于模型組 （P＜0.05）。病理切片顯示，燙傷膏劑組和陽性對照組與模型組相比，肉芽組織、表皮及真皮中汗腺形成速度明顯增快。免疫組化切片顯示，7、10、14 d燙傷膏劑組和陽性對照組的EGF、bFGF表達數(shù)量多于模型組 （P＜0.05）。燙傷后48 h，與模型組相比，燙傷膏劑組和陽性對照組的血清IL-1β水平明顯減低（P＜0.05）。結(jié)論燙傷膏對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面有明顯的促進修復(fù)的作用，其機制與增加EGF、bFGF的合成，降低血清IL-1β水平有關(guān)。

燙傷膏；大鼠深Ⅱ度燙傷；IL-1β；EGF；bFGF

由火焰、熱液、電等物理因素和強酸、強堿等化學物質(zhì)引起的組織損傷統(tǒng)稱為燒燙傷，它是日常生活與工作中的常見病。近年來，中藥在燒燙傷治療應(yīng)用上有了長足的發(fā)展，由遼寧中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥實驗中心研制的燙傷膏在臨床中反復(fù)驗證，對各種原因引起的燒燙傷具有良好的治療效果，該膏劑由大黃、黃柏等中藥組成，具有清熱解毒、活血祛瘀及生肌斂瘡的作用。本研究通過采用大鼠深Ⅱ度燙傷模型，進一步闡明燙傷膏的治療作用，為其臨床推廣提供理論和實驗依據(jù)。

1 實驗動物和材料

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量180～200 g，生產(chǎn)許可證號 SCXK（遼）2003-0007，使用許可證號SYXK（遼）2003-00011。

1.2 藥物和試劑

1.2.1 藥物 燙傷膏劑由大黃、黃柏、熟地黃、骨碎補中藥組成，遼寧中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥實驗中心提供。主要制作工藝流程：將處方中藥物用8倍量的75%乙醇分別提取2次，回收乙醇，濃縮至1.25的浸膏；京萬紅軟膏 （批號211974）由天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司提供。

1.2.2 試劑 IL-1β酶聯(lián)免疫檢測試劑盒由上海源葉生物科技有限公司提供；EGF（批號20131209W）及bFGF（批號131111W）由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供；兔IgG—免疫組化試劑盒SABC即用型（批號NO.09c11B）及DAB顯色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 主要實驗儀器 自備燙傷裝置 （取用一塊22 cm×11 cm×1 cm的木板，中間挖一個長軸4.3 cm，短軸3.3 cm的橢圓形孔），AS325型多功能切片機（英國SHANDON公司），Histocetre2包埋機（英國SHANDON公司），離心機（長沙湘儀離心機有限公司），DHG-9033BS-Ⅲ型電熱恒溫水浴箱 （上海圣科儀器有限公司），日本NIKON顯微鏡，秒表，電子天平。

2 方法

2.1 模型制備［1］取雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量180～200 g，用10%硫化鈉脫毛，隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組、燙傷膏劑組。24 h后，取模型組、陽性對照組、燙傷膏劑組大鼠，用10%水合氯醛 （0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，然后將大鼠仰臥固定在燙傷木板上，背部裸露的皮膚暴露在木板孔內(nèi)，然后將木板放置在電熱恒溫水浴箱上，輕度按壓木板使背部裸露皮膚浸入80℃水中15 s，隨后立即注射滅菌0.9%氯化鈉溶液 （2.5 mL/ 100 g）復(fù)蘇，48 h后取創(chuàng)傷組織并制作病理切片，光境下觀察，表皮及真皮乳頭層損傷，真皮深層殘留部分汗腺，細胞水腫，伴有大量炎細胞浸潤，證實為大鼠深Ⅱ度燙傷。

2.2 分組給藥 燙傷后的大鼠單籠飼養(yǎng)，模型組，陽性對照組，燙傷膏劑組3組，每組25只。創(chuàng)面每日換2次藥，生理鹽水沖洗后，陽性對照組外敷京萬紅軟膏，燙傷膏劑組外敷燙傷膏，給藥部位用無菌紗布縫扎固定，連續(xù)21 d。

3 觀察指標

3.1 創(chuàng)面愈合率 燙傷后1、7、14、21 d用透明硫酸紙描記創(chuàng)面，以此為模板，將質(zhì)地均勻的硬紙板剪成同樣大小，然后用電子天平稱定質(zhì)量，以質(zhì)量代替面積，依據(jù)創(chuàng)面愈合率=（原始燙傷面積-各時間點未愈合面積）/原始燙傷面積［2］，計算創(chuàng)傷愈合率。

3.2 大體形態(tài)觀察 每日觀察并記錄各組大鼠創(chuàng)面淤血水腫、結(jié)痂及痂皮脫落、上皮化等創(chuàng)面情況。

3.3 病理組織學觀察 分別于燙傷后7、10、14、21 d，每組取5只大鼠，切取創(chuàng)面外緣皮膚，經(jīng)福爾馬林固定后，石蠟切片，切片用于免疫組化和HE染色，對于HE染色的切片，需要觀察不同時間點創(chuàng)傷皮膚表皮再生、真皮中汗腺、炎細胞浸潤、肉芽組織中毛細血管及成纖維細胞生長情況。

3.4 EGF、bFGF表達測定 切片經(jīng)脫蠟，3%過氧化氫浸泡，高壓修復(fù)，封閉液孵育，加入EGF、bFGF抗體后，再先后加入羊抗兔、SABC，之后DAB顯色，蘇木素復(fù)染及脫水透明封片。顯微鏡下觀察EGF、bFGF陽性細胞的胞漿呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。在高倍鏡下每張切片選取3個視野，每個視野100個細胞，觀察并記錄100個細胞中陽性細胞數(shù)，計算平均值。

3.5 燙傷大鼠血清制備及血清IL-1β測定 燙傷后48 h，每組取大鼠5只，10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，3 500 r/m in離心15 min，取上清液后，根據(jù)ELISA試劑盒中提供的操作步驟測定血清IL-1β水平。

4 統(tǒng)計學處理

計量資料以x±s表示，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

5 結(jié)果

5.1 創(chuàng)面愈合率 與模型組相比，陽性對照組和燙傷膏劑組在燙傷后7、14、21 d創(chuàng)面愈合率明顯升高，并且有顯著性差異 （P＜0.05）。此結(jié)果表明燙傷膏對深Ⅱ度燙傷大鼠創(chuàng)面有明顯修復(fù)作用，見表1。

表1 各時間點創(chuàng)面愈合率比較 （%，x±s，n=5）

5.2 大體形態(tài)觀察 空白對照組大鼠精神飲食活動正常，脫毛處為正常皮膚，無腫脹變白。各組大鼠燙傷后精神萎靡，飲食減少，創(chuàng)面蒼白，略腫脹，與周圍組織分界清楚，皮膚彈性降低，韌性增加。燙傷后24 h，模型組、陽性對照組、燙傷膏劑組大鼠精神狀態(tài)逐漸恢復(fù)，飲食量逐漸增加，創(chuàng)面瘀血，呈點片狀，腫脹明顯，結(jié)硬痂，痂下有積膿。燙傷后7 d，模型組、陽性對照組、燙傷膏劑組大鼠精神食欲恢復(fù)正常，空白對照組大鼠脫毛處新生白毛，模型組創(chuàng)面呈少量點狀瘀血，水腫不明顯，硬痂變軟，痂皮脫落不明顯，痂下積膿明顯；陽性對照組和燙傷膏劑組創(chuàng)面無瘀血水腫，硬痂變軟，創(chuàng)面周邊部分痂皮有脫落。燙傷后14 d，空白對照組大鼠脫毛處基本恢復(fù)脫毛前狀態(tài)，模型組創(chuàng)面無瘀血水腫，創(chuàng)面痂皮部分脫落，已脫落表面不平坦；陽性對照組和燙傷膏劑組創(chuàng)面痂皮大部分脫落，脫落部分露出新鮮肉芽組織，表面光滑平坦。燙傷后21 d，模型組創(chuàng)面痂皮大部分脫落，表面不光滑；陽性對照組和燙傷膏劑組創(chuàng)面大部分被表皮覆蓋。

5.3 病理組織學觀察 空白對照組在7 d，14 d及21 d組織切片表現(xiàn)為表皮層次分明，真皮中大量汗腺生長，充滿大量呈編織狀膠原纖維。燙傷后7 d，陽性對照組及燙傷膏劑組模型組壞死組織部分脫落，并且有成纖維細胞及毛細血管生成；模型組壞死組織開始從創(chuàng)緣剝脫，壞死組織與創(chuàng)緣交界處有大量炎細胞浸潤。燙傷后14 d，陽性對照組和燙傷膏劑組大部分壞死組織脫落，表皮爬行于創(chuàng)緣表面，有較多成纖維細胞及毛細血管的生成；模型組部分壞死組織脫落，表皮爬行速度緩慢，與陽性對照組及燙傷膏劑組相比，有較少成纖維及毛細血管的生成。燙傷后21 d，陽性對照組和燙傷膏劑組表皮基本覆蓋創(chuàng)緣表面且表皮結(jié)構(gòu)成熟，真皮內(nèi)有大量汗腺生成，成纖維細胞產(chǎn)生大量較多膠原纖維，同時成纖維細胞數(shù)量減少、胞核變細長，變?yōu)槔w維細胞，并且毛細血管數(shù)量減少；模型組壞死組織全部脫落，表皮尚未全部覆蓋創(chuàng)面，表皮下有成纖維細胞及毛細血管。見圖1。

圖1 大鼠燙傷后各時間點創(chuàng)面組織病理切片 （×100）

5.4 EGF、bFGF表達 燙傷后7、10、14 d，陽性對照組和燙傷膏劑組EGF、bFGF表達高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。燙傷后21 d，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），燙傷后7、10、14、21 d陽性對照組和燙傷膏劑組EGF、bFGF表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2﹑表3及圖2、圖3。

表2 每組各個時間點EGF陽性細胞數(shù)量比較 （個，x±s，n=5）

表3 每組各個時間點bFGF陽性細胞數(shù)量比較 （個，x± s，n=5）

圖2 大鼠燙傷后第10天各組創(chuàng)面組織EGF表達

圖3 大鼠燙傷后第10天各組創(chuàng)面組織bFGF表達

5.5 血清IL-1β水平 從表4中可見，燙傷后48 h燙傷膏劑明顯降低大鼠血清IL-1β水平，與陽性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），同模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。

表4 燙傷后48 h IL-1β比較（x±s，n=5）

6 討論

創(chuàng)面愈合過程主要包括炎癥反應(yīng)期，細胞增殖期及結(jié)構(gòu)重塑期。組織損傷后，中性粒細胞和單核巨噬細胞等多種炎癥細胞向創(chuàng)面聚集，進入創(chuàng)面的單核巨噬細胞合成并分泌多種生長因子。這些生長因子刺激成纖維細胞及內(nèi)皮細胞遷移至創(chuàng)面，并且不斷增殖。啟動增殖過程后，內(nèi)皮細胞及成纖維細胞持續(xù)合成并分泌多種生長因子，進一步促進創(chuàng)面愈合。EGF及bFGF是生長因子家族中的重要成員。其中EGF是一種多肽類物質(zhì)，可刺激表皮角質(zhì)細胞和纖維細胞增殖，促進新血管的形成和核酸蛋白質(zhì)的合成。而bFGF主要促進成纖維細胞及內(nèi)皮細胞增殖，進而促進肉芽組織形成及新生毛細血管化［3-5］。由實驗結(jié)果可知，燙傷后7、10、14 d，陽性對照組和燙傷膏劑組EGF、bFGF表達高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05），說明京萬紅和燙傷膏促進細胞合成和分泌EGF、bFGF，進而加快肉芽組織形成和上皮化速度，促進創(chuàng)傷愈合。

嚴重燒傷后中性粒細胞 （PMN）等炎癥細胞活化，釋放大量細胞因子等炎癥介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)與創(chuàng)傷后全身性炎癥反應(yīng)的關(guān)系密切［6］。曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分創(chuàng) （燒）傷患者血液中PMN的凋亡受到明顯抑制［7-8］。延遲凋亡的PMN積聚于組織中，壞死脫顆粒時可釋放大量毒性物質(zhì)，例如酶類和超氧離子，引起細胞變性壞死，進而促進多器官功能衰竭 （MODS）［8］，因而創(chuàng)傷后局部炎癥反應(yīng)持續(xù)存在并加重的關(guān)鍵因素是PMN凋亡延遲［9］。我們認為從整體角度看，嚴重燒傷后釋放的IL-6和IL-1等細胞因子，是引起創(chuàng)傷后PMN凋亡延遲的重要影響因素。本實驗結(jié)果表明，燙傷后1 d，燙傷膏劑及京萬紅明顯降低血清中IL-1β水平，同模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05），說明燙傷膏劑抑制IL-1β生成，解除PMN凋亡延遲，減輕炎癥反應(yīng)，促進創(chuàng)面愈合。

綜合上述，燙傷膏劑增加EGF和bFGF的合成，同時抑制血清IL-1β生成，促進創(chuàng)面愈合。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）06-1335-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.040

2014-07-20

韓 斌（1987—），碩士生。Tel：18241651013，E-mail：1792360568@qq.com

*通信作者：王志義，碩士生導師。