黃麗杰， 崔永霞， 劉 偉， 張偉欣， 林帥軍， 李 睢

（河南中醫(yī)學(xué)院分析測(cè)試中心，河南鄭州450008）

HPLC法同時(shí)測(cè)定胡頹子葉中槲皮素和山柰酚

黃麗杰， 崔永霞， 劉 偉*， 張偉欣， 林帥軍， 李 睢

（河南中醫(yī)學(xué)院分析測(cè)試中心，河南鄭州450008）

目的建立同時(shí)定量測(cè)定胡頹子葉中槲皮素和山柰酚的方法。方法胡頹子葉鹽酸-乙醇提取液分析采用反相高效液相色譜法，ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl Analytical色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)366 nm；進(jìn)樣量10μL。結(jié)果槲皮素和山柰酚在2.4～48μg/mL（r=0.999 8）和12.8～256μg/mL（r=0.999 9）范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為98.8%、99.4%，RSD值分別為1.7% （n=6）、1.1% （n=6）。不同產(chǎn)地胡頹子葉中槲皮素和山柰酚的含有量范圍分別為0.299 3～2.12 mg/g、2.864 3～8.079 7 mg/g。結(jié)論該法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，對(duì)胡頹子葉的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)有一定的參考價(jià)值。

胡頹子葉；槲皮素；山柰酚；HPLC

胡頹子葉為胡頹子科胡頹子屬常綠植物胡頹子Elaeagnus pungens Thunb.的干燥葉，其性平、味酸，具有斂肺、平喘、止咳的作用［1］。是用于止咳平喘的中成藥海珠喘息定片等的主要原料藥材，臨床效果良好［2］。胡頹子葉的化學(xué)成分有單寧、黃酮苷、生物堿、有機(jī)酸、三萜及甾醇類(lèi)化合物等［3-11］。目前對(duì)于胡頹子葉中化學(xué)成分的定量測(cè)定報(bào)道研究很少，為深入挖掘我國(guó)寶貴的中藥資源，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，同時(shí)測(cè)定了不同產(chǎn)地胡頹子葉中槲皮素和山柰酚的量，為胡頹子葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)、控制及進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

安捷倫1260高效液相色譜儀 （美國(guó)安捷倫科技有限公司）；METTLER AE240電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；FN202-2型電熱干燥箱 （長(zhǎng)沙儀器儀表廠）；元素型1820C摩爾純水機(jī) （上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）；RT-01型粉碎機(jī) （浙江溫嶺市大海藥材器械廠）；HWS型水浴鍋 （上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

甲醇、乙腈 （色譜純，Tedia公司）；磷酸（分析純，洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水（自制）；槲皮素對(duì)照品 （批號(hào)110824，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司），山柰酚對(duì)照品 （批號(hào)MUST-13121112，成都曼思特生物科技有限公司）；胡頹子葉由河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為胡頹子科胡頹子屬植物胡頹子的干燥葉，產(chǎn)地分別為廣西、云南、河南、安徽、江蘇、四川、貴州、湖北、陜西、蘄春。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl Ana-lytical（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液 （A）-乙腈 （B），梯度洗脫（0～5 min，10%～15%B；5～10 min，15%～20%B；10～15 min，20%～25%B；15～20 min，25%～28%B；20～25 min，28%～28%B；25～30 min，28%～30%B；30～35 min，30%～40% B）；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)366 nm；進(jìn)樣量10μL。按此色譜條件檢測(cè)對(duì)照品溶液與供試品溶液，結(jié)果供試品中槲皮素和山柰酚的色譜峰與其他色譜峰均分離良好，峰形對(duì)稱(chēng)。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品（A）及胡頹子葉樣品（B）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances（A）and leaves of E.pungens（B）

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取槲皮素和山柰酚對(duì)照品適量，置25mL量瓶中，各加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即分別得每1 mL含40 μg的槲皮素對(duì)照品溶液和每1 mL含0.3 mg的山柰酚的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取藥材粉末約1 g，精密稱(chēng)定，置平底燒瓶中，精密加入25%鹽酸-乙醇（1∶4）100 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取 “2.2”項(xiàng)下兩個(gè)對(duì)照品溶液適量，各配制成質(zhì)量濃度為2.4、12、24、36、48μg/m L的槲皮素對(duì)照品溶液和質(zhì)量濃度為12.8、64、128、192、256μg/mL的山柰素對(duì)照品溶液，各精密進(jìn)樣10μL，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算得槲皮素的線性回歸方程為Y=3.163 8X-2.021，r=0.999 8；山柰酚的線性回歸方程為Y=6.871 5X-5.665 7，r=0.999 9，結(jié)果表明，槲皮素在2.4～48μg/mL（r= 0.999 8）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，山柰酚在12.8～256μg/mL（r=0.999 9）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取槲皮素和山柰酚對(duì)照品溶液適量，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD，槲皮素和山柰酚的RSD值分別為0.3%（n=6）和0.8%（n=6）。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取按 “2.3”項(xiàng)下的制備條件制成的供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h測(cè)定峰面積，槲皮素RSD值為1.4% （n=6），山柰酚RSD值為0.6% （n=6），結(jié)果表明槲皮素和山柰酚的量均未發(fā)生明顯的改變，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地的胡頹子葉藥材粉末適量，精密稱(chēng)定，平行6份，制備成供試品溶液，測(cè)定峰面積，分別計(jì)算槲皮素和山柰酚的量，結(jié)果其RSD值分別為0.6% （n=6）和1.1%（n=6），表明實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取江蘇產(chǎn)地已知槲皮素和山柰酚含有量的胡頹子葉藥材粉末約0.5 g，平行6份，分別精密加入槲皮素對(duì)照品0.62 mg和山柰酚對(duì)照品3.2 mg，按“2.3”項(xiàng)下的制備方法進(jìn)行處理并按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，測(cè)得量帶入 “2.4”項(xiàng)下線性方程中，顯示在線性范圍內(nèi)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品測(cè)定 精密稱(chēng)取胡頹子葉樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算各樣品中槲皮素和山奈酚的含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 提取條件的優(yōu)化

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 提取方法的考察 精密稱(chēng)取胡頹子葉 （江蘇）粉末1 g，精密加入25%鹽酸-乙醇 （1∶4）100 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，分別采用超聲提取30 min和回流提取1.5 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，放置至室溫，稱(chēng)定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液。結(jié)果顯示超聲提取得到的槲皮素和山柰酚含有量明顯較低，而回流提取得到含有量較高的槲皮素和山柰酚，故采用回流提取方法。

表1 加樣回收率試驗(yàn) （n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 （mg/g）Tab.2 Determ ination results of sam p les（mg/g）

3.1.2 提取溶劑的考察 精密稱(chēng)取胡頹子葉 （江蘇）粉末1 g，精密加入25%鹽酸-85%乙醇 （1∶4）、25%鹽酸-乙醇 （1∶4）、25%鹽酸-85%甲醇（1∶4）、25%鹽酸-甲醇 （1∶4）各100 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，回流提取1.5 h，放置至室溫，稱(chēng)定質(zhì)量，用不同比例的溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液。結(jié)果表明用25%鹽酸-乙醇 （1∶4）提取所得的槲皮素和山柰酚的含有量較高，色譜峰分離度好，故選擇用25%鹽酸-乙醇 （1∶4）作為提取溶劑。

3.2 正交試驗(yàn)

3.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以槲皮素和山柰酚的含有量為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，考察提取溶劑、體積、時(shí)間、次數(shù)這4個(gè)因素。精密稱(chēng)取胡頹子葉（江蘇）粉末9份，每份1g。因素水平見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)因素水平Tab.3 Orthogonal test factors and levels

采用綜合評(píng)分法和正交軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出提取溶劑和溶劑體積有極顯著性，提取時(shí)間和次數(shù)無(wú)顯著性，故最優(yōu)提取條件為A3B3C1D1。

3.2.2 正交試驗(yàn)驗(yàn)證 以?xún)?yōu)化提取條件A3B3C1D1重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果表明所選提取工藝條件槲皮素和山柰酚含有量平均值均比正交最高值高，故最終確定最佳提取條件為A3B3C1D1。

4 結(jié)果與討論

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 考察了波長(zhǎng)在360 nm和366 nm下的出峰情況，在366 nm下所測(cè)得的峰面積比360 nm處所測(cè)得的峰面積大，檢測(cè)靈敏度高，且基線平穩(wěn)，故選擇366 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

4.2 柱溫的選擇 考察了不同柱溫 （20、25、30、35、40℃）對(duì)槲皮素和山柰酚分離效果的影響，結(jié)果顯示柱溫在30℃時(shí)，槲皮素和山柰酚的分離效果均較好。

4.3 測(cè)定結(jié)果分析 由表2可以看出，貴州的胡頹子葉統(tǒng)貨藥材中槲皮素的含有量最高，安徽產(chǎn)地含有量最低；蘄春產(chǎn)地胡頹子葉中山柰酚的含有量最高，安徽產(chǎn)地的含有量最低。結(jié)果顯示，這可能和藥材的品種差異、產(chǎn)地環(huán)境、氣候溫度、生長(zhǎng)方式、采摘時(shí)間等因素有密切關(guān)系。本結(jié)果對(duì)規(guī)范胡頹子葉的栽培管理，提高胡頹子葉的質(zhì)量具有一定的意義和價(jià)值。

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Assay of quercetin and kaem pferol in leaves of Elaeagnus pungens by HPLC

HUANG Li-jie， CUIYong-xia， LIUWei*， ZHANGWei-xin， LIN Shuai-jun， LISui
（Analysis and Testing Center，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

Elaeagnus pungens；quercetin；kaempferol；HPLC

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1302-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.031

2014-09-04

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目 （102102310089）

黃麗杰 （1988—），女，碩士生，從事現(xiàn)代儀器分析方法在藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中的應(yīng)用研究。

*通信作者：劉 偉 （1955—），男，教授，長(zhǎng)期從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和儀器分析方法的研究。Tel： （0371）65575838，E-mail：hnliuwei2088@sina.com