張耀雷， 黃立新*， 張彩虹，2， 謝普軍， 游 鳳

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實(shí)驗(yàn)室，國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210042；2.中國林業(yè)科學(xué)院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京100091）

壺瓶棗多糖的分離及其抗氧化活性

張耀雷1， 黃立新1*， 張彩虹1，2， 謝普軍1， 游 鳳1

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實(shí)驗(yàn)室，國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210042；2.中國林業(yè)科學(xué)院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京100091）

目的研究壺瓶棗多糖的分離純化及其抗氧化活性。方法壺瓶棗粗多糖用D900型大孔吸附樹脂和DEAE-纖維素-52柱層析分離，以去離子水和0～1mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，并考察其不同組分清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力。結(jié)果分離純化得到3個(gè)中性多糖組分（ZJP-1、ZJP-3和ZJP-5）和2個(gè)酸性多糖組分（ZJP-2和ZJP-4），并對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力。其中ZJP-2清除超氧陰離子自由基能力較強(qiáng)；ZJP-4清除羥基自由基能力較強(qiáng)；ZJP-5清除以上兩種自由基能力均較強(qiáng)。結(jié)論D900型大孔吸附樹脂和DEAE-纖維素-52的分離純化效果較好，而且分離所得的5種多糖組分的抗氧化活性各有特點(diǎn)。

壺瓶棗；多糖；純化；抗氧化活性

紅棗是鼠李科棗屬植物棗樹Ziziphus Jujuba Mill.的果實(shí)，在我國栽培歷史悠久，種植面積大，現(xiàn)已發(fā)展出包括壺瓶棗Ziziphus Jujuba Mill. cv.Hupingzao在內(nèi)的700多個(gè)品種。紅棗不僅是滋補(bǔ)佳品，而且也是一味傳統(tǒng)的中藥，因富含營養(yǎng)和保健成分而享譽(yù)中外，為我國傳統(tǒng)藥食兼用果品［1］。多糖是自然界濃度最豐富的生物聚合物，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一。研究發(fā)現(xiàn)多糖為紅棗的主要功能性成分之一［2］，具有抗腫瘤、降血脂、抗衰老、抗病毒、抗?jié)兊榷喾N生理活性［3］，并且多糖類藥物在癌癥的輔助治療中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等優(yōu)點(diǎn)［4］。因此，多糖類產(chǎn)品是紅棗深加工的可選擇方向之一。目前關(guān)于紅棗多糖的研究主要停留在提取分離階段，而其后續(xù)研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)采用D900型大孔吸附樹脂和DEAE-纖維素-52柱層析對(duì)壺瓶棗粗多糖進(jìn)行分離純化，并研究了其不同組分的抗氧化作用，以期獲得具有良好生物活性的高純度多糖組分，為開發(fā)紅棗功能性食品及藥品提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步提高我國紅棗資源的深加工附加值。

1 材料與儀器

1.1 材料 紅棗，產(chǎn)地為山西省太谷縣，購于南京市鎖金村農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)中國林科院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所王成章研究員鑒定為壺瓶棗；D900型大孔吸附樹脂，購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司；DEAE-纖維素-52，購于阿拉丁試劑有限公司；MD44透析袋（分子質(zhì)量為3 500），購于Biosharp生物科技有限公司。

1.2 試劑 葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、DPPH、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸、七水合氯化亞鐵、水楊酸、雙氧水、三羥甲基氨基甲烷、Vc、鹽酸、鄰苯三酚，均為分析純 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 儀器設(shè)備 JM型膠體磨（溫州市康而達(dá)實(shí)業(yè)有限公司）；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海索譜儀器有限公司）；Wizard 2.0型真空冷凍干燥機(jī)（美國VirTis公司）；分析天平（美國奧豪斯公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵和RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海東璽制冷儀器有限公司）；UV-2102PC紫外可見分光光度儀 （上海尤尼科光譜設(shè)備有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)及測(cè)定方法

2.1 壺瓶棗粗多糖的分離純化 壺瓶棗粗多糖溶液400 mL（多糖質(zhì)量濃度20.12 mg/mL），以D900型大孔吸附樹脂作為柱子 （75 mm×1 200 mm）的層析填料進(jìn)行分離純化，4倍體積的去離子水以10 m L/min的體積流量進(jìn)行洗脫，每50 m L隔管檢測(cè)，作洗脫曲線 （苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)多糖質(zhì)量濃度，280 nm下吸光值跟蹤檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度）；用DEAE-纖維素-52層析柱（20 mm×500 mm）對(duì)所得不同組分多糖進(jìn)行純化，用去離子水和0～1 mol/L的NaCl溶液以0.5 mL/min的體積流量洗脫，每6 mL隔管檢測(cè)，作洗脫曲線，收集不同組分，濃縮后透析48 h。

2.2 多糖的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法［5］，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取80℃下干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖對(duì)照品0.100 g，定容至1 000 mL，配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于帶塞試管中，各以蒸餾水補(bǔ)充至2.0 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的重蒸苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，水浴10 min，室溫放置20 min后，于490 nm下測(cè)吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程C=0.066 6A-0.000 3（r= 0.999 1）。

2.3 蛋白質(zhì)的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法［6］，制作牛血清白蛋白 （BSA）標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取0.1 g牛血清白蛋白，定容至100 m L，配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，各以蒸餾水補(bǔ)充至1.0 mL，加入4 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，室溫下反應(yīng)5 min，在595 nm下測(cè)其吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程C=0.123 2A-0.006 5（r=0.998 1）。

2.4 多糖的紫外-可見光譜分析 取壺瓶棗粗多糖溶液與D900型大孔吸附樹脂柱層析后所得不同組分多糖，配制成多糖質(zhì)量濃度為0.4 mg/m L的溶液，在190～700 nm的紫外-可見波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，考察純化效果。

2.5 多糖的抗氧化活性分析

2.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［7］并做部分修改，1 mg/mL的多糖溶液2 mL與0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL在室溫下保存30 min于517 nm下測(cè)吸光值A(chǔ)1；取蒸餾水代替多糖溶液，測(cè)吸光值A(chǔ)0；取乙醇代替DPPH溶液，測(cè)吸光值A(chǔ)2，按下式計(jì)算清除率，以VC作對(duì)照。

2.5.2 羥基自由基清除能力的測(cè)定 采用Fenton體系產(chǎn)生·OH，水楊酸法檢測(cè)羥基及樣品清除·OH的能力［8］。1 mg/m L的多糖溶液1 mL，9 mmol/L的FeSO4溶液1 m L，9 mmol/L的水楊酸乙醇溶液1 mL，8.8 mmol/L的H2O2溶液1 mL在37℃下水浴30 min，于510 nm下測(cè)吸光值A(chǔ)1；取蒸餾水代替多糖溶液，測(cè)吸光值A(chǔ)0；1 mL多糖溶液與3 mL蒸餾水混合，測(cè)吸光值A(chǔ)2，按下式計(jì)算清除率，以VC作對(duì)照。

2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法［9］，1 mg/mL的多糖溶液0.5 mL與5mL PH為8.2的Tris-HCl溶液于25℃下反應(yīng)20 min，加10 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL于320 nm下測(cè)吸光度A1；取蒸餾水代替多糖溶液，測(cè)吸光值A(chǔ)0，繪制吸光度值與時(shí)間曲線，斜率即為自氧化速率。按下式計(jì)算清除率，以VC作對(duì)照。

3 結(jié)果與討論

3.1 壺瓶棗粗多糖的分離 利用D900型大孔吸附樹脂層析柱對(duì)壺瓶棗粗多糖進(jìn)行分離純化，洗脫結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，粗多糖經(jīng)過柱色譜洗脫分離后，可以收到Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個(gè)部分，多糖回收率為86.75%，脫蛋白率為89.41%。

圖1 粗多糖的D900型大孔吸附樹脂柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of crude polysaccharides on themacroporous adsorption resin D900 colum n

3.2 多糖的紫外-可見光譜分析 為了考察D900型大孔吸附樹脂柱的分離純化效果，對(duì)原液及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三部分多糖溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見圖2。由圖2可知，未經(jīng)色譜柱處理的壺瓶棗粗多糖溶液在280 nm處有一個(gè)肩峰，且在可見光區(qū)有較大吸收，經(jīng)層析后，280 nm處肩峰消失，且多糖溶液在可見光區(qū)無吸收，說明粗多糖的分離純化效果較為明顯。這是因?yàn)镈900型大孔吸附樹脂可吸附含羥基、氨基、共扼雙鍵和氫鍵的物質(zhì)。由于蛋白質(zhì)是一種富含氨基酸和氫鍵的物質(zhì)，因此可以被大孔樹脂吸附［10］，并且蒸餾水不能將其洗脫下來。多糖雖然具有多羥基結(jié)構(gòu)，但由于其易形成分子內(nèi)氫鍵，故減弱了與大孔樹脂形成氫鍵的能力［11］，因此，蒸餾水可以將多糖從D900型大孔吸附樹脂柱上洗脫下來，達(dá)到將其與蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)分離的目的。

圖2 多糖溶液的紫外-可見光吸收曲線Fig.2 Ultraviolet-visible absorption curve of the polysaccharides solution

3.3 粗多糖的分級(jí)純化 用DEAE-纖維素-52層析柱對(duì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三部分多糖進(jìn)行分級(jí)純化，洗脫曲線分別見圖3、圖4及圖5。在洗脫曲線中，各個(gè)組分洗脫峰狹窄對(duì)稱，說明分離效果較好。由圖3和圖4可知，組分Ⅰ和Ⅱ的多糖經(jīng)柱層析后均可得到兩個(gè)組分，其中由去離子水洗脫后，可得到一個(gè)中性多糖組分和一個(gè)酸性多糖組分，分別為ZJP-1和ZJP-3；由0～1.0 mol/L的NaCl溶液線性梯度洗脫后，可得到一個(gè)酸性多糖組分，分別為ZJP-2和ZJP-4。由圖5可知，組分Ⅲ經(jīng)柱層析后，只得到一個(gè)中性多糖組分ZJP-5。

3.4 5種多糖組分的抗氧化活性

3.4.1 5種多糖組分的DPPH自由基清除能力

圖3 組分Ⅰ的DEAE-纖維素-52柱層析洗脫曲線Fig.3 Elution curve of fractionⅠon the DEAE-cellulose-52 column

圖4 組分Ⅱ的DEAE-纖維素-52柱層析洗脫曲線Fig.4 Elution curve of fractionⅡon the DEAE-cellulose-52 column

圖5 組分Ⅲ的DEAE-纖維素-52柱層析洗脫曲線Fig.5 Elution curve of fractionⅢon the DEAE-cellulose-52 column

DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其孤對(duì)電子在517 nm附近有強(qiáng)吸收，有機(jī)清除劑可使孤對(duì)電子被配對(duì)，通過測(cè)定吸收減弱的程度可評(píng)價(jià)自由基清除劑的活性［12］。由圖6可知，5種多糖組分均具有一定的DPPH自由基清除能力，但作用較弱，且其清除率隨濃度變化而增加緩慢；同質(zhì)量濃度壺瓶棗多糖的DPPH自由基清除能力弱于Vc，順序?yàn)閆JP-5＞ZJP-4＞ZJP-1＞ZJP-2＞ZJP-3，其中當(dāng)ZJP-5質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL時(shí)，其清除率趨于穩(wěn)定，為21.32%。

圖6 5種多糖組分的DPPH自由基清除能力Fig.6 Scavenging capacity to·DPPH of five fractions

3.4.2 5種多糖組分的羥基自由基清除能力 羥基自由基是活性氧中最活潑的自由基，但是毒性最大，它幾乎能與活細(xì)胞中任何分子發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)速度極快，對(duì)機(jī)體破壞作用最大，因此羥基自由基清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標(biāo)［13］。由圖7可知，5種多糖組分均具有羥基自由基清除能力，與多糖濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，質(zhì)量濃度越高，其清除能力越強(qiáng)；同質(zhì)量濃度壺瓶棗多糖的羥基自由基清除能力弱于Vc，順序?yàn)閆JP-5＞ZJP-4＞ZJP-2＞ZJP-3＞ZJP-1，其中當(dāng)ZJP-4和ZJP-5質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL時(shí)，其清除率分別為43.82%和53.31%。

圖7 5種多糖組分的羥基自由基清除能力Fig.7 Scavenging capacity to hydroxyl radical of five fractions

3.4.3 5種多糖組分的超氧陰離子自由基清除能力 超氧陰離子自由基在氧化反應(yīng)中扮演著非常重要的角色，是所有自由基的前身。在生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)中，有2%～5%的氧會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，其毒性是機(jī)體發(fā)生氧中毒的主要原因，因此超氧陰離子自由基清除率也是反映藥物抗氧化作用的重要指標(biāo)之一［14］。由圖8可知，5種多糖組分均具有超氧陰離子自由基清除能力，與多糖質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，質(zhì)量濃度越高，其清除能力越強(qiáng)；同質(zhì)量濃度壺瓶棗多糖的羥基自由基清除能力弱于Vc，順序?yàn)閆JP-2＞ZJP-5＞ZJP-3＞ZJP-1＞ZJP-4，其中當(dāng)ZJP-2和ZJP-5質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL時(shí)，其清除率分別為 46.12%和32.30%。

圖8 5種多糖組分的超氧陰離子自由基清除能力Fig.8 Scavenging capacity to superoxide anion radical of five fractions

4 結(jié)論

壺瓶棗粗多糖經(jīng)過D900型大孔吸附樹脂柱層析后可得到Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個(gè)部分，多糖回收率和脫蛋白率分別為86.75%和89.41%；全波長(zhǎng)掃描后發(fā)現(xiàn)，三個(gè)部分多糖在可見光區(qū)幾乎無吸收，在280 nm處也無吸收峰。綜上可知，D900型大孔吸附樹脂柱的分離純化效果較為明顯。

DEAE-纖維素-52層析柱對(duì)所得3個(gè)組分進(jìn)行純化，其中組分Ⅰ可得到一個(gè)中性多糖組分ZJP-1和一個(gè)酸性多糖組分ZJP-2，組分Ⅱ可得到一個(gè)中性多糖組分ZJP-3和一個(gè)酸性多糖組分ZJP-4，組分Ⅲ只能得到一個(gè)中性多糖組分ZJP-5。

對(duì)純化后所得5種多糖組分進(jìn)行抗氧化活性研究，以Vc作參照物。結(jié)果表明，多糖的抗氧化活性均弱于Vc，且5種多糖組分對(duì)DPPH自由基的清除能力均較弱；ZJP-2清除超氧陰離子自由基能力較強(qiáng)，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL時(shí)，其清除率為46.12%；ZJP-4清除羥基自由基能力較強(qiáng)，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL時(shí)，其清除率為43.82%；ZJP-5清除羥基自由基和超氧陰離子自由基能力都比較強(qiáng)，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為3.5 mg/m L時(shí)，其清除率分別為53.31%和32.30%。因此，ZJP-2、ZJP-4和ZJP-5的組成有必要做進(jìn)一步分析，以確定其中活性多糖組分。

［1］馮新光，呂吉鴻，郭澤峰，等.中國不同產(chǎn)地紅棗的組分分析與評(píng)價(jià)［J］.中國釀造，2012，31（9）：30-33.

［2］王 軍，張寶善，陳錦屏.紅棗營養(yǎng)成分及其功能的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2003，24（2）：68-72.

［3］唐 潔.植物多糖生物活性功能的研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27（5）：130-132.

［4］王雪姣，徐文清.地衣多糖的結(jié)構(gòu)特征與生物活性［J］.天津藥學(xué)，2007，19（2）：62-64.

［5］Li JW，F(xiàn)an L P，Ding SD.Isolation，purifcation and structure of a new water-soluble polysaccharide from Zizyphus jujuba cv.Jinsixiaozao［J］.Carbohydr Polym，2011，83（2）：477-482.

［6］Bradford M M.A rapid and sensitivemethod for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72（2）：248-254.

［7］Wang D Y，Zhao Y，Jiao Y D，etal.Antioxidative and hepatoprotective effects of the polysaccharides from Zizyphus Jujuba cv.Shaanbeitanzao［J］.Carbohydr Polym，2012，88（4）：1453-1459.

［8］Wang B.Chemical characterization and ameliorating effect of polysaccharide from Chinese Jujuba on intestine oxidative injury by ischemia and reperfusion［J］.Int J Biol Macromol，2011，48（3）：386-391.

［9］Chang SC，Hsu B Y，Chen B H.Structural characterization of polysaccharides from Zizyphus jujuba and evaluation of antioxidant activity［J］.Int J Biol Macromol，2010，47（4）：445-453.

［10］羅艷玲，歐仕益.大孔樹脂在食品活性成分分離中的應(yīng)用［J］.食品與機(jī)械，2005，21（5）：81-83.

［11］王小梅，孫潤(rùn)廣，張 靜，等.兩種方法提取的麥冬多糖結(jié)構(gòu)及聚集行為的比較研究［J］.電子顯微學(xué)報(bào)，2013，32（1）：54-61.

［12］田春蓮，蔣鳳開，文赤夫.飛龍掌血清除自由基活性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（11）：106-108.

［13］郅 潔，李炳奇，廉宜君，等.沙棗多糖的提取及其抗氧化活性的研究［J］.中成藥，2009，31（5）：796-798.

［14］丁宏偉，李志香，蔡云飛.微波輔助超聲提取南瓜多糖及其抗氧化性研究［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34（1）：35-39.

Purification of polysaccharides from Ziziphus Jujuba M ill.cv.Hupingzao and the antioxidant activities

ZHANG Yao-lei1， HUANG Li-xin1*， ZHANG Cai-hong1，2， XIE Pu-jun1， YOU Feng1
（1.Instituteof Chemical Industry of Forest Products，Chinese Academy of Forestry；National Engineering Laboratory for BiomassChemical Utilization；Key and Open Laboratory on Forest Chemical Engineering，State Forestry Administration；Key Laboratory of Biomass Energy and Material，Nanjing 210042，China；2.Institute of New Technology of Forestry，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China）

AIMTo study the isolation and purification of polysaccharides from Ziziphus Jujuba Mill.cv. Hupingzao and the antioxidantactivity of these polysaccharides.METHODSThe crude polysaccharideswere purified bymacroporous adsorption resin D900 and DEAE-cellulose-52 column chromatography，eluted with deionized water and 0～1 mol/L NaCl solution.The scavenging capacities of DPPH，hydroxy-and superoxide-free radicals were alsomeasured.RESULTSThree neutral polysaccharide fractions（ZJP-1，ZJP-3，ZJP-5）and two acidic polysaccharide fractions（ZJP-2，ZJP-4）were obtained.The five fractions all had scavenging capacity for DPPH. Among them，ZJP-5 was the strong scavenger for hydroxyl and superoxide anion radicals，ZJP-2 for superoxide anion radical，and ZJP-4 for hydroxyl radical.CONCLUSIONThemacroporous adsorption resin D900 and DEAE-cellulose-52 both have good purifying effect on polysaccharides，and the antioxidant activities of isolated five polysaccharides have different characteristics.

Ziziphus Jujuba Mill.cv.Hupingzao；polysaccharide；purification；antioxidant activity

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1267-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.023

2014-09-16

國家林業(yè)局948項(xiàng)目 （2012-4-12）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 （CAFINT2013C04）

張耀雷 （1989—），男，碩士，從事農(nóng)林產(chǎn)品深加工研究工作。

*通信作者：黃立新 （1967—），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，從事天然產(chǎn)物提取分離純化及新型干燥技術(shù)研究。E-mail：l_x_ huang@163.com