林 君， 李 昊

（1.上海方心科技研究所，上海200032；2.上海市同濟(jì)醫(yī)院，上海200065）

升白合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

林 君1， 李 昊2*

（1.上海方心科技研究所，上海200032；2.上海市同濟(jì)醫(yī)院，上海200065）

目的建立一種便捷、準(zhǔn)確檢測(cè)升白合劑的質(zhì)量的方法。方法采用薄層色譜法對(duì)升白合劑中補(bǔ)骨脂、淫羊藿、虎杖進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜法測(cè)定黃芪甲苷和淫羊藿苷的量。結(jié)果薄層色譜斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好；黃芪甲苷在4.326～43.260μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系 （r=0.999 7），平均加樣回收率98.0%，RSD為1.7%（n=6）；淫羊藿苷在0.312～12.480μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系 （r= 0.999 9），平均加樣回收率102.0%，RSD為1.9%（n=6）。結(jié)論本法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能夠有效控制升白合劑的質(zhì)量。

升白合劑；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；黃芪甲苷；淫羊藿苷；高效液相色譜法

升白合劑由黃芪、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、虎杖、三七、桃仁等13味中藥組成，是上海市同濟(jì)醫(yī)院臨床治療白細(xì)胞減少癥數(shù)十年的經(jīng)驗(yàn)方。方中淫羊藿辛溫助陽，黃芪補(bǔ)氣益血，二者共為君藥補(bǔ)氣溫陽以益血，補(bǔ)骨脂、三七、虎杖、山茱萸為臣藥，共助君藥補(bǔ)氣活血、溫腎助陽；當(dāng)歸、丹參、雞血藤、黃精、女貞子、紅花、桃仁共為佐使藥，滋陰益氣養(yǎng)血活血并防止主藥溫陽過甚；全方共奏活血溫腎，補(bǔ)益氣血之效，能夠緩和而持久地提升白細(xì)胞、臨床初步應(yīng)用總有效率在90%左右［1］。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)［2-4］，升白合劑可有效保護(hù)輻射對(duì)細(xì)胞核物質(zhì)的損害，促進(jìn)血細(xì)胞的再生，減輕輻射對(duì)造血系統(tǒng)的毒性損傷作用，其藥效機(jī)理與促進(jìn)人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 （GM-CSF）的生成密切相關(guān)，對(duì)胃癌細(xì)胞有較明顯的生長(zhǎng)抑制作用。為更好地控制升白合劑的質(zhì)量，對(duì)該制劑生產(chǎn)工藝進(jìn)行了研究和規(guī)范，并在此基礎(chǔ)上研究制定了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其中的補(bǔ)骨脂、淫羊藿、虎杖3味藥材采用薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別，對(duì)黃芪和淫羊藿采用高效液相色譜法分別以黃芪甲苷和淫羊藿苷為指標(biāo)進(jìn)行定量測(cè)定［5-6］。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可以作為本品的質(zhì)量檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 510-486型高效液相色譜儀；Empower色譜工作站；AE240型電子分析天平（梅特勒公司）；CQ-250型超聲波清洗儀，功率200 W，頻率40 kHz。

1.2 試藥 淫羊藿苷 （批號(hào)110737-200415），補(bǔ)骨脂素 （批號(hào)110739-201115），異補(bǔ)骨脂素 （批號(hào) 110738-201012）， 大 黃 素 （批 號(hào) 110756-201010），黃芪甲苷 （批號(hào)110781-200613），均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；薄層色譜用硅膠G（青島海洋化工有限公司）；升白合劑，上海中藥三廠生產(chǎn)，150 mL/瓶，批號(hào)分別為20130601、20130602、20130603；陰性對(duì)照由實(shí)驗(yàn)室自制；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑為分析純。

2 定性鑒別

2.1 補(bǔ)骨脂的薄層色譜鑒別 取本品20 mL，加乙酸乙酯萃取3次 （30 mL，30 mL，20 mL），合并萃取液，水浴蒸干，加甲醇10 mL，超聲使溶解，作為供試品溶液。取不含補(bǔ)骨脂的陰性合劑樣品20 mL，同法制成陰性對(duì)照溶液。取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含1.0 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯 （4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，晾干，置紫外燈 （365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。詳見圖1。

2.2 淫羊藿薄層色譜鑒別 取本品20 mL，加乙酸乙酯萃取3次（30 mL，30 mL，20 mL），合并萃取液，水浴蒸干，加甲醇10 mL，超聲使溶解，作為供試品溶液；取不含淫羊藿的陰性合劑樣品20 mL，依同樣方法制成陰性對(duì)照溶液；取淫羊藿苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 （《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-水 （13∶7∶2∶3）的下層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至顯色清晰，日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色斑點(diǎn)，詳見圖2。

圖1 補(bǔ)骨脂薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Psoraleae Fructus

圖2 淫羊藿薄層色譜圖Fig.2 TLC ch romatogram of Epimedii Folium

2.3 虎杖薄層色譜鑒別 取本品20 mL，加乙酸乙酯萃取3次 （30 mL，30 m L，20 mL），合并萃取液，水浴蒸干，加甲醇10 m L，超聲使溶解，作為供試品溶液；取不含虎杖的陰性合劑樣品20 mL，依同樣方法制成陰性對(duì)照溶液；取大黃素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 （《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸 （8∶2∶2∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈 （365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。詳見圖3。

圖3 虎杖薄層色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

3 樣品中成分測(cè)定

3.1 黃芪甲苷測(cè)定

3.1.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6mm× 250 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-水 （32∶68）；體積流量1.0 m L/min；柱溫為室溫；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；漂移管溫度 105℃；氣體體積流量 2.7 L/min；進(jìn)樣量20μL。

3.1.2 樣品制備

3.1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每1 mL含黃芪甲苷2.163 0 mg的溶液，作為貯備液。

3.1.2.2 供試品溶液的制備 取本品搖勻，精密吸取100mL，減壓蒸干，加2%氫氧化鉀甲醇溶液100 mL，水浴回流1 h，過濾，濾液濃縮至干，殘?jiān)铀?00 mL，用水飽和正丁醇萃取4次 （30 mL、30 mL、20 mL、20 mL），合并正丁醇液，用正丁醇飽和水洗3次（30 mL、20 mL、20 mL），正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

3.1.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方取除黃芪以外的各藥材，按本品制備工藝制備陰性樣品，精密吸取100 mL，按供試品溶液的制備方法操作，制得陰性對(duì)照溶液。

3.1.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 經(jīng)過試驗(yàn)，在乙腈-水（32∶68）條件下，樣品中黃芪甲苷主峰對(duì)稱性良好，與相鄰峰分離度較好，色譜柱的理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算為13 735，陰性對(duì)照沒有干擾，故確定流動(dòng)相組成和比例，并暫定色譜柱的理論板數(shù)按黃芪甲苷計(jì)應(yīng)不低于4 000，詳見圖4。

圖4 黃芪甲苷的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of astragaloside A

3.1.4 線性關(guān)系考察 取2.163 0 mg/mL的黃芪甲苷貯備液，分別精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0 mL，用甲醇稀釋并定容至10mL，制成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液 （0.216 3，0.432 6，0.865 2，1.297 8，2.163 0 mg/mL），分別精密吸取20μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以進(jìn)樣量 （μg）的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo) （X），峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo) （Y），得回歸方程：y=2.124 5x+ 2.594 1，r=0.999 7，表明黃芪甲苷在4.326～43.260μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果RSD為0.7%，表明儀器精密度良好。

3.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取升白合劑樣品，按“3.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定，RSD為1.4%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取升白合劑 （批號(hào)20130601），按 “3.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得供試品溶液5份，依次測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，平均質(zhì)量濃度為0.087 mg/mL，RSD為1.7%。

3.1.8 回收率試驗(yàn) 精密量取升白合劑樣品6份（批號(hào)20130601，含黃芪甲苷0.087 mg/mL），每份50 mL，分別精密加入2.163 0 mg/mL的黃芪甲苷對(duì)照品溶液2 mL，按“3.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，依次測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)Tab.1 Results of recovery tests

3.2 淫羊藿苷測(cè)定

3.2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-1.5%冰醋酸 （60∶40）；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣量5μL。

3.2.2 樣品制備

3.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每1 mL含淫羊藿苷2.496 0 mg的溶液，作為貯備液。

3.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品搖勻，精密吸取5 mL，加甲醇4 mL，混勻，過濾，用50%甲醇洗滌濾渣，合并濾液與洗液，定容至10 m L，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

3.2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方取除淫羊藿以外的各藥材，按本品制備工藝制備陰性樣品，精密吸取5 m L，加甲醇4 mL，混勻，過濾，用50%甲醇洗滌濾渣，合并濾液與洗液，定容至10 mL，濾過，取續(xù)濾液，作為陰性對(duì)照溶液。

3.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 經(jīng)過試驗(yàn)，在乙腈-1.5%冰醋酸 （60∶40）條件下，樣品中淫羊藿苷主峰對(duì)稱性良好，與相鄰峰達(dá)到基線分離，色譜柱的理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算為6 357，陰性對(duì)照沒有干擾，故確定流動(dòng)相組成和比例，并暫定色譜柱的理論板數(shù)按淫羊藿苷計(jì)應(yīng)不低于4 000，詳見圖5。

圖5 淫羊藿苷的HPLC圖譜Fig.5 HPLC ch romatogram s of icariin

3.2.4 線性關(guān)系考察 取2.496 0 mg/mL的淫羊藿苷貯備液，分別精密吸0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，加甲醇稀釋并定容至20 mL，取制成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液 （0.062 4，0.124 8，0.249 6，0.624 0，1.248 0，2.496 0 mg/mL），分別精密吸取5μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以進(jìn)樣量 （μg）為橫坐標(biāo) （x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），得回歸方程：y=2×106x-21594，r= 0.999 9，表明淫羊藿苷在0.312～12.480μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液5μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果RSD為0.7%，表明儀器精密度良好。

3.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取升白合劑樣品，按“3.2.2”項(xiàng)供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果RSD為 1.6%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取升白合劑 （批號(hào)20130601），按 “3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得供試品溶液5份，依次測(cè)定，淫羊藿苷平均含有量為0.45 mg/mL，RSD為2.4%。

3.2.8 回收率試驗(yàn) 精密量取升白合劑樣品 （批號(hào)20130601）6份，每份2.5 mL，分別精密加入0.465 mg/mL的淫羊藿苷對(duì)照品溶液2.0 mL，按“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，依次測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)Tab.2 Results of recovery tests

3.3 樣品測(cè)定 取批號(hào)20130601、20130602、20130603升白合劑樣品，按分別按 “3.1”項(xiàng)和“3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定黃芪甲苷和淫羊藿苷，結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.3 Determ ination resu lts of samples（n=3）

4 討論

根據(jù) 《中國(guó)藥典》2010年版 “補(bǔ)骨脂”的鑒別方法描述，2個(gè)對(duì)照品均應(yīng)顯藍(lán)白色熒光斑點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)中曾試驗(yàn)過不同點(diǎn)樣量，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)顏色會(huì)隨點(diǎn)樣量不同而發(fā)生變化，補(bǔ)骨脂素可以顯橙色斑點(diǎn)，異補(bǔ)骨脂素可以顯黃色斑點(diǎn)，因此在本研究中，將檢視結(jié)果描述為：供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

樣品處理方法選擇：在淫羊藿苷的定量測(cè)定試驗(yàn)中，根據(jù)文獻(xiàn) ［6-7］，結(jié)合本制劑情況，選擇了以下幾種方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)：①取本品搖勻，精密吸取20 mL，加乙酸乙酯萃取3次，分別加30、30、20 mL，合并乙酸乙酯層，水浴蒸干，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得；②取本品搖勻，精密吸取20 mL，加乙酸乙酯萃取3次，分別加30、30、20 m L，合并乙酸乙酯層，加5%碳酸鈉洗滌2次，每次10 mL，乙酸乙酯層水浴蒸干，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得；③取本品搖勻，精密吸取5 mL，加甲醇定容至10 mL，即得；④取本品搖勻，精密吸取5 mL，加甲醇4 mL，混勻，過濾，用50%甲醇洗滌濾渣，合并濾液與洗液，定容至10 mL，即得。

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，方法③測(cè)得值最高，但是試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該方法樣品中有大量沉淀，會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，方法④測(cè)得值略低但更準(zhǔn)確，因此選定方法④處理樣品。

惡性腫瘤已經(jīng)成為人類健康的 “頭號(hào)殺手”，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，而腫瘤患者因放療、化療使造血干細(xì)胞和骨髓微環(huán)境的損傷而引起的白細(xì)胞減少癥也在不斷增加。升白合劑為純中藥制劑，提升白細(xì)胞作用明顯，作用持久，副作用小，價(jià)格低廉，如果能擴(kuò)大臨床應(yīng)用無疑是廣大腫瘤患者的福音?，F(xiàn)代研究表明［8-12］，升白合劑中的主要藥物補(bǔ)骨脂、淫羊藿、黃芪、虎杖，均有明確的抗腫瘤、提升白細(xì)胞作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)升白合劑中的補(bǔ)骨脂、淫羊藿、虎杖三味藥材進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜法測(cè)定黃芪甲苷和淫羊藿苷的量，能簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地反映產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量水平，為工業(yè)化生產(chǎn)、擴(kuò)大臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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［3］李 昊，何生奇，楊慧萍，等.升白合劑對(duì)輻照后Beagle犬血細(xì)胞的影響［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2006，26（5）：473-474.

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Quality standard for ShengbaiM ixture

LIN Jun1， LIHao2*
（1.Shanghai Fetion Science&Technology Institute，Shanghai 200032，China；2.Shanghai Tongji Hospital，Shanghai 200065，China）

ShengbaiMixture；quality standard；astragaloside A；icariin；high performance liquid chromatography

R927.2

：A

：1001-1528（2015）06-1239-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.018

2014-07-11

上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金 （2012Y001A）

林 君（1975—），工程師。Tel：（021）64225262，E-mail：linjun911@163.com

*通信作者：李 昊（1965—），男，主任醫(yī)師。Tel：（021）66111027，E-mail：lihao148@hotmail.com

ABSTRACT：AIMTo establish the quality standard for Shengbai Mixture.METHODSPsoraleae Fructus，Epimedii Folium，Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix were identified by thin-layer chromatography（TLC），and the content of astragaloside A and icariin were determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.RESULTSThe TLC spots developed were fairly clear，and the blank test showed no interference.As to the HPLCmethods，a good linearity was shown in the range from 4.326μg to 43.260μg for astragaloside A（r= 0.999 7）with 98.0%the average recovery rate and 1.7%RSD，in the range from 0.312μg to 12.480μg for icariin（r=0.999 9）with 102.0%the average recovery rate and 1.9%RSD.CONCLUSIONThemethods are simple，accurate and reproducible，and can be used to control the quality of ShengbaiMixture.