王明希， 雷海民

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102）

響應(yīng)面法優(yōu)化瓜蔞肽類物質(zhì)提取條件

王明希， 雷海民*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102）

目的探討響應(yīng)面Box-Behnben中心組合方法優(yōu)化瓜蔞中肽類物質(zhì)的提取。方法運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)方法確定提取過(guò)程中超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比等3個(gè)主要影響因素。在此基礎(chǔ)上二次多項(xiàng)回歸方程的ANOVA分析。結(jié)果

瓜蔞；肽類物質(zhì)；響應(yīng)曲面法

瓜蔞古稱栝樓，是葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.或雙邊栝樓T.rosthornii Harms的干燥成熟果實(shí)，主要分布于我國(guó)華南和西南地區(qū)。瓜蔞具有寬胸散結(jié)、潤(rùn)燥滑腸、清熱滌痰等功效，為治療胸痹的要藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究，其可抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血小板凝聚，且對(duì)肝損傷、心腦血管損傷有保護(hù)作用［1-3］。但是在2010年版 《中國(guó)藥典》中瓜蔞的質(zhì)量控制還停留在浸出物的測(cè)定階段，無(wú)成分定量測(cè)定［4］。因此，對(duì)瓜蔞有效成分的進(jìn)一步探索，便顯得尤為重要。

肽（peptide）是由氨基酸的胺基 （-NH2）和羧基（-COOH）脫水縮合形成肽鍵后，形成的鏈狀分子。隨著肽類物質(zhì)研究的深入，從中藥中分離出具有提高免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、降脂降壓等活性的肽類成分的報(bào)道日益增多［5-6］。一些研究也報(bào)道了瓜蔞中肽類物質(zhì)的抗癌活性與使核糖體失活的作用［7-8］。因此，本實(shí)驗(yàn)探討了響應(yīng)面法優(yōu)化瓜蔞中肽類物質(zhì)的提取工條件，為其活性物質(zhì)的分離、純化、藥理活性探究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

FA2104S型電子分析天平 （上海光學(xué)儀器一廠）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀 （北京醫(yī)療設(shè)備二廠）；TDL-5-A CENTRZFUGE高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；R-1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；JP-800B-8D型萬(wàn)能粉碎機(jī) （久品工貿(mào)有限公司）。R13010042、R13010043 pH精密試紙 （上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）。

瓜蔞產(chǎn)于山西省運(yùn)城市新絳縣，購(gòu)于同仁堂，由北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為栝樓T.kirilowii Maxim的干燥成熟果實(shí)。經(jīng)曬干、切絲。

2 方法與結(jié)果

2.1 肽類物質(zhì)的提取 將瓜蔞飲片粉碎，過(guò)40目篩。石油醚脫脂 （石油醚與瓜蔞粉末的比例為1∶4，脫脂4次，每次4 h），將脫脂后的瓜蔞粉末于通風(fēng)陰涼處放置12 h，待用。精密稱取瓜蔞粉末20 g于燒杯中，加入一定量去離子水，并且調(diào)節(jié)溶液pH值為8.4。將盛有樣品的燒杯置于超聲清洗儀中，超聲頻率為200 W。超聲時(shí)間按照實(shí)驗(yàn)條件分別取50、60、70 min，離心 （3 500 r/min，15 min）取上清液，待用。再用1 mol/L的鹽酸將上清液的pH值梯度調(diào)節(jié)到8.0、7.6、7.2、6.8、6.4、6.0、5.6、5.2，每一梯度均離心 （3 800 r/min，5 min）取沉淀，用相應(yīng)的pH值溶液洗滌2～3次。將上述8份沉淀合并于燒杯中加入于沉淀同體積的去離子水，并將溶液pH值調(diào)節(jié)為7.0，沉淀溶解，呈澄清溶液，待用作為樣品液。肽類物質(zhì)的鑒定方法為 （1）雙縮脲反應(yīng)：取樣品液2 mL于試管中加等體積雙縮脲試劑，溶液由無(wú)色變?yōu)樽仙?（2）考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)：取考馬斯亮藍(lán)試劑2 mL于試管中，滴加樣品液，溶液迅速由紅色變?yōu)樗{(lán)色。說(shuō)明此樣品液中，含有肽類物質(zhì)；糖類物質(zhì)的去除方法為 （1）苯酚-硫酸法：取樣品液5 mL于試管中加苯酚-硫酸試劑，無(wú)橙黃色化合物生成。（2）二硝基水楊酸法：取樣品液5 mL于試管中加二硝基水楊酸試劑，無(wú)棕紅色。表明糖類物質(zhì)，除去效果較好。將樣品液置于冷凍干燥機(jī)中，冷凍干燥，待用。以此肽類物質(zhì)粗提物的質(zhì)量和原料質(zhì)量比計(jì)算提取率。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲溫度對(duì)提取率的影響 固定超聲時(shí)間為60 min，料液比為1/30，其他提取條件不變。超聲溫度分別取30、40、50、60、70℃，每個(gè)溫度點(diǎn)各做3次平行實(shí)驗(yàn)。此5個(gè)溫度條件對(duì)應(yīng)的提取率為 13.36、41.32、52.11、47.99、26.81 mg/g。在50℃時(shí)提取效果最好。隨著溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，促進(jìn)肽類物質(zhì)溶出，提取效率增加。但是溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致肽類物質(zhì)變性，隨雜質(zhì)離心去除。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響 固定超聲溫度為50℃，料液比為1/30，其他提取條件不變。超聲時(shí)間分別取40、50、60、70、80 min，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各做3次平行實(shí)驗(yàn)。此5個(gè)不同超聲時(shí)間對(duì)應(yīng)的提取率為 20.11、44.72、53.12、46.09、22.78 mg/g。在60 min時(shí)提取效果最好。適當(dāng)?shù)某晻r(shí)間，使肽類物質(zhì)的在藥材內(nèi)與提取中達(dá)到動(dòng)平衡，促進(jìn)溶出。但過(guò)長(zhǎng)時(shí)間處于50℃環(huán)境中，也可能導(dǎo)致肽類物質(zhì)變性沉淀，耐高溫雜質(zhì)大量溶出，影響提取率。

2.2.3 料液比對(duì)提取率的影響 固定超聲時(shí)間為60 min，超聲溫度為50℃，其他提取條件不變。料液比分別取1/10、1/20、1/30、1/40、1/50，每個(gè)料液比各做3次平行實(shí)驗(yàn)。此5個(gè)料液比條件對(duì)應(yīng)的提取率為 9.32、21.22、49.56、30.32、18.02 mg/g。在1/30時(shí)提取效果最好。加提取液初期，水量較少時(shí)，瓜蔞粉末中果膠類、多糖類、纖維素吸水膨脹使溶液整體呈果凍狀，肽類被包裹，溶出較少。隨水量增大，而提取率增高。但是從料液比達(dá)到1∶30時(shí)提取率下降。料液比較大，大量肽類分散于提取液中，導(dǎo)致肽類物質(zhì)在下一步離心、酸沉過(guò)程中，損失較多。

2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化瓜蔞肽類物質(zhì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)選用了響應(yīng)曲面法中的Box-Behnben中心組合方法建立試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在上述單因素試?yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲溫度 （A），超聲時(shí)間（B），料液比 （C）3個(gè)主要因素作為自變量，瓜蔞中肽類物質(zhì)的提取率作為響應(yīng)值。設(shè)計(jì)了3因素3水平的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。試?yàn)設(shè)計(jì)見表1。

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Design Expert 8.0.6.1進(jìn)行多元回歸擬合，得出本次實(shí)驗(yàn)因變量瓜蔞肽類物質(zhì)的提取率 （Y）與3個(gè)自變量超聲溫度 （A），超聲時(shí)間 （B），料液比 （C）的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

Y=-505.3+8.810A+9.475B+2.930C-9.625E-0.030AB+0.019AC+0.020BC-0.085A2-0.079B2-0.085C2

此二次多項(xiàng)回歸方程的ANOVA分析表，見表2。模型的F值為270.27，P＜0.000 1，有顯著差異，證明造模成功。失擬項(xiàng)為0.074 5，沒有顯著差異，證明模型的失擬程度不大。R2為0.997 1表示模型的模擬程度較好良好。

表1 Box-Behnben中心組合方法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.1 Box-Behnken test design and results

表2 二次多項(xiàng)回歸方程的ANOVA分析Tab.2 Significance test resu lts of regression equation

3個(gè)自變量超聲溫度 （A），超聲時(shí)間 （B），料液比 （C）的交互作用可通過(guò)3D圖形、等高線圖顯現(xiàn)出來(lái)，見圖1。

通過(guò)對(duì)比分析三個(gè)因素的等高線圖與響應(yīng)面圖，可見三種因素之間的交互作用均較明顯，坡面均較陡，呈鐘罩型。其中超聲溫度 （A）與超聲時(shí)間 （B）的響應(yīng)面最陡，等高線間距小，對(duì)提取率的影響最大。

通過(guò)Design Expert軟件的Box-Behnben中心組合法極值求解，可得瓜蔞中肽類物質(zhì)的最佳提取工藝為：超聲溫度52℃，超聲時(shí)間61 min，料液比為1/30。預(yù)測(cè)最高提取率為53.70 mg/g。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面分析法得出的最優(yōu)工藝，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)條件為超聲溫度52℃，超聲時(shí)間61 min，料液比為1/30對(duì)瓜蔞中肽類物質(zhì)進(jìn)行提取，水平重復(fù)5次，得肽類物質(zhì)的平均提取率為53.60 mg/g（RSD=2.845%）。與預(yù)測(cè)值較為吻合。

3 討論

雖然種子類蛋白物質(zhì)的提取工藝，已有大量文獻(xiàn)［9-10］報(bào)道。但是含糖、油脂量較大的中藥飲片中的肽類物質(zhì)提取工藝，卻鮮有報(bào)道。瓜蔞飲片為果實(shí)類藥材，含有大量的果膠、多糖、纖維素、肽類、油脂類化合物等。不同于以往中藥化學(xué)研究領(lǐng)域中的黃酮、生物堿等小分子活性物質(zhì)，這些生物大分子在溶出過(guò)程中均以膠體形式存在，物理、化學(xué)性質(zhì)相似，大大增加了肽類物質(zhì)的提取難度。尤其是，至今尚未有多糖與肽類物質(zhì)的各自保持活性的通用分離方法。Sevag法雖然可以使肽類物質(zhì)從混合溶液中沉淀出來(lái)，但肽類物質(zhì)因接觸氯仿、三氯醋酸，并經(jīng)過(guò)劇烈振搖，已喪失活性。生物化學(xué)領(lǐng)域較為成熟的動(dòng)物蛋白提取方法，會(huì)嚴(yán)重造成肽類種類的缺失，均不適合照搬應(yīng)用于中藥材的研究過(guò)程中。

肽類物質(zhì)在提取過(guò)程中極易變性沉淀，造成提取效率下降，有效物質(zhì)活性降低。易使其變性的化學(xué)條件有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽、有機(jī)試劑等；易使其變性的物理方法有加高溫、紫外線照射、劇烈振蕩或攪拌等。提取條件些許的變化即可嚴(yán)重影響肽類物質(zhì)的提取率。本次實(shí)驗(yàn)，提取條件均能較溫和，pH選用范圍小，經(jīng)堿提酸沉后，沉淀復(fù)溶為澄清溶液，表示沒有破壞其空間結(jié)構(gòu)。提取過(guò)程中無(wú)需長(zhǎng)期高溫加熱，沒有使用有機(jī)試劑，很好的保持了瓜蔞肽類物質(zhì)的活性。料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度三個(gè)提取條件的適宜選擇，使肽類物質(zhì)的提取率顯著增加。

響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）可以分析因變量與多個(gè)自變量間的回歸關(guān)系，多用二項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果的表達(dá)。其可將自變量與因變量的函數(shù)關(guān)系用3D圖形展示出來(lái)，結(jié)果直觀、簡(jiǎn)潔［11-12］。Box-Behnben中心組合法試驗(yàn)方案中沒有將所有試驗(yàn)因素同時(shí)安排為高水平的試驗(yàn)組合，可以安全、有效的指導(dǎo)試驗(yàn)進(jìn)行，已被廣泛使用［13-14］。這種方法尤其適用于多因素交叉影響產(chǎn)率的實(shí)驗(yàn)，因此，我們選用了響應(yīng)曲面法中Box-Behnben中心組合方法首次建立提取瓜蔞中肽類物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢?duì)其提取條件進(jìn)行了合理優(yōu)化。

本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)曲面法得出最佳提取工藝為：超聲溫度52℃，超聲時(shí)間61 min，料液比為1/30.04。預(yù)測(cè)最高提取率為53.70 mg/g。最優(yōu)工藝條件下實(shí)際肽類物質(zhì)的平均提取率為53.60 mg/g。與預(yù)測(cè)值較為吻合。綜上，響應(yīng)曲面法可準(zhǔn)確優(yōu)化瓜蔞肽類物質(zhì)的提取工藝，為含糖、油脂量較大的中藥飲片的肽類物質(zhì)提取工藝的研究發(fā)展，提供了可靠參考。

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Response surfacemethodology for optim ization of the extraction of peptides from Trichosanthes kirilowii M axim.

WANGMing-xi， LEIHai-min*
（School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Trichosanthes kirilowii Maxim.；peptides；response surfacemethodology

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1221-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.014

2014-07-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81173519）；北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目 （2011-CXTD-15）

王明希 （1990—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幓钚怨央姆治龇蛛x方法的構(gòu)建。Tel：18511896085，E-mail：wmx6085@ 126.com

*通信作者：雷海民（1968—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幓钚怨央姆治龇蛛x方法的構(gòu)建。E-mail：leihaimin@126.com

瓜蔞肽類物質(zhì)的最佳提取條件為：超聲溫度52℃，超聲時(shí)間61 min，料液比為1/30。在此條件下，瓜蔞中肽類物質(zhì)預(yù)測(cè)最高提取率為53.70mg/g。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證值為53.60mg/g。結(jié)論瓜蔞肽類物質(zhì)的提取時(shí)的實(shí)際值與響應(yīng)曲面法預(yù)測(cè)值較為接近。