姜 茜 李 頎 張 震 肖 萍 蘇 琳 苗春越 李 龍

先天性巨結(jié)腸(hirschsprung disease，HSCR，OMIM# 142623)又稱腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥(congenital aganglionosis)，是導(dǎo)致功能性腸梗阻的最常見的小兒消化道畸形，屬典型腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)先天發(fā)育異常性疾病。主要病理特征是病變腸段肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如伴神經(jīng)纖維增生、腸道神經(jīng)調(diào)節(jié)紊亂，以致受累腸段持續(xù)異常收縮，近端結(jié)腸代償性擴(kuò)張、增厚，形成巨結(jié)腸?，F(xiàn)已明確HSCR 是一種神經(jīng)嵴細(xì)胞(neural crest cell，NCC)源性疾病，發(fā)病與胚胎期NCC 在腸道內(nèi)的遷移、增殖、分化、成熟異常有關(guān)。根據(jù)受累腸段的范圍，本病可分為短段型(最常見，約占全部HSCR 的80%)、長(zhǎng)段型(15%)及全結(jié)腸型(5%)3 種。HSCR平均發(fā)生率1/5000，存在明顯種族差異:亞洲人群最高，為2.8/10000［1］。我國(guó)屬高發(fā)生率國(guó)家。近年來(lái)通過(guò)連鎖分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析研究、基因敲除以及動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)并確定了至少11 個(gè)基因攜帶的高外顯率、罕見致病突變(high penetrance，rare mutation)以及低外顯率、常見單核苷酸多態(tài)性(low penetrance，common polymorphism)，可以解釋部分表型與基因型之間的關(guān)聯(lián)［2］。盡管如此，在所有已知易感基因累積發(fā)現(xiàn)的突變僅能解釋不足10%的患者的發(fā)病原因，高度提示其他致病基因或危險(xiǎn)因子的存在［3］。

Semaphorins 家族基因編碼的分子是一類系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上高度保守的分泌型或跨膜糖蛋白，屬較早發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典的神經(jīng)元軸突導(dǎo)向因子(axon guidance cues)。根據(jù)結(jié)構(gòu)特征共可分為8 個(gè)亞族，其中Semaphorin 3(SEMA3)是唯一表達(dá)于脊椎動(dòng)物的分泌型蛋白，包括7 個(gè)亞類分子(SEMA3A ～SEMA3G)，可通過(guò)自分泌或旁分泌等方式在局部和遠(yuǎn)距離都發(fā)揮調(diào)控作用［4］。從最初發(fā)現(xiàn)時(shí)起，Semaphorins 家族分子即因在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用而備受關(guān)注，其功能主要包括調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移，神經(jīng)元極性、增殖和分化，樹突棘的密度及其成熟，軸突生長(zhǎng)、修剪和突觸成熟等［5～8］。近期Semaphorin 3 家族分子在ENS 發(fā)育乃至HSCR 中的作用開始逐漸受到學(xué)界關(guān)注［9，10］。本研究擬對(duì)前期在HSCR 患者篩查、發(fā)現(xiàn)的5 個(gè)SEMA3C/SEMA3D 基因錯(cuò)義突變進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)其對(duì)Semaphorin 3 蛋白表達(dá)的影響作用及各自程度，從而為該基因家族參與疾病發(fā)生提供更多證據(jù)。

材料與方法

1.細(xì)胞系和質(zhì)粒:HEK293T 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。N-端AP -tagged 野生型小鼠SEMA3C 和SEMA3D 表達(dá)質(zhì)粒由美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)Aravinda Chakravarti 教授饋贈(zèng)。

2.主要試劑和液體配制:細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 和質(zhì)粒大提試劑盒(PureLink?HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit)購(gòu)自Invitrogen 公司。突變誘導(dǎo)試劑盒(QuikChange?Lightning Site - Directed Mutagenesis Kits)購(gòu)自Agilent Technologies 公司。AP -SEMA3 融合蛋白定量檢測(cè)試劑(2 ×SEAP)組分PNPP、Diethanolamine Substrate Buffer 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司;L-Homoarginine hydrochloride、BSA 購(gòu)自Sigma 公司。蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail Tablets)購(gòu)自Roche 公司。HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)液:添加青霉素、鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM。2 ×SEAP:1mmol/L MgCl2，

4mol/L Diethanolamine，4.5mg/ml L -Homoarginine hydrochloride，1mg/ml BSA，8.9mg/ml PNPP。lysis buffer:1% Triton，10mmol/L Tris (pH 8.0)。

3. 實(shí)驗(yàn)方法:(1)突變質(zhì)粒誘導(dǎo)及構(gòu)建:登陸Agilent QuikChange Primer Design 網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物，按照突變誘導(dǎo)試劑盒說(shuō)明書的步驟合成突變質(zhì)粒DNA，進(jìn)而轉(zhuǎn)化相應(yīng)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增和提取。(2)HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:體外培養(yǎng)處于健康狀態(tài)的HEK293T 細(xì)胞(傳代20 代以內(nèi))，待匯合度接近100%時(shí)以1∶4傳代于預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸(0.1mg/ml)包被的10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，大約24h 后將培養(yǎng)液更換為無(wú)抗生素的10% 胎牛血清DMEM。8μg 質(zhì)粒DNA(已經(jīng)構(gòu)建好的5種突變質(zhì)粒及相應(yīng)野生型全長(zhǎng)cDNA 表達(dá)質(zhì)粒)與12μl Lipofectamine 2000 分別于400μl DMEM 液中室溫放置5min，混合后顛倒混勻，室溫放置20min，簡(jiǎn)短、快速離心后將質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑的混合液加入10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，超凈臺(tái)內(nèi)水平輕柔混勻，放置于37℃孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后12h，將細(xì)胞培養(yǎng)液置換為低血清含量的OPTI -MEM 培養(yǎng)液(Invitrogen公司)并于置換培養(yǎng)液72h 后收集培養(yǎng)皿內(nèi)含有AP-SEMA3融合蛋白的液體，室溫2000 ×g 離心5min 以去除細(xì)胞殘?jiān)?，將上清轉(zhuǎn)移至新的50ml Corning 管中于4℃保存?zhèn)溆谩?3)AP-SEMA3 融合蛋白定量檢測(cè):參照Flanagan 等［11］的方法，將含有AP-SEMA3 融合蛋白的培養(yǎng)液上清或總蛋白用lysis buffer 按不同比例稀釋至100μl，與事先加至Corning Costar Cell Culture 板中的100μl 2 ×SEAP 混合，錫箔紙包裹避光轉(zhuǎn)移至versamax microplate reader，將機(jī)器波長(zhǎng)讀取值調(diào)整至405nm 并將檢測(cè)時(shí)間總長(zhǎng)和間隔分別設(shè)定為60s 和15s，放入細(xì)胞培養(yǎng)板開始進(jìn)行檢測(cè)。(4)HEK293T 細(xì)胞總蛋白提取:向10ml lysis buffer 內(nèi)加入1 片蛋白酶抑制劑，反復(fù)顛倒混勻以助溶解。收集培養(yǎng)液上清之后的HEK293T 細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 清洗1 遍，然后徹底吸凈PBS，加入含蛋白酶抑制劑的lysis buffer，用一次性細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移至1.5ml Ep 管內(nèi)。冰上放置30min 后4℃低溫離心機(jī)離心，12000r/min，20min，最后將上清轉(zhuǎn)移至新的Ep 管中保存?zhèn)溆谩?5)AP-SEMA3 與FLAGHoxb7 質(zhì)粒雙轉(zhuǎn)染:為了除外野生型與各突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率不同對(duì)融合蛋白表達(dá)量差異的可能干擾作用，筆者建立了一組AP-SEMA3 質(zhì)粒與FLAG-Hoxb7 質(zhì)粒雙轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，并用60μg HEK293T 細(xì)胞胞質(zhì)蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析。

結(jié) 果

1.5 個(gè)SEMA3C/SEMA3D 基因錯(cuò)義突變:研究者前期對(duì)254 例先天性巨結(jié)腸患者的3 個(gè)Semaphorin 3家族基因(SEMA3A、SEMA3C、SEMA3D)進(jìn)行測(cè)序篩查，一共發(fā)現(xiàn)了12 個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)受累氨基酸化學(xué)性質(zhì)分析、序列保守性分析和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，最終決定選取其中的5 個(gè)突變進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。突變位點(diǎn)的詳細(xì)信息見表1。

表1 5 個(gè)SEMA3C/SEMA3D基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)詳細(xì)信息

2.AP -SEMA3 融合蛋白的檢測(cè):利用融合蛋白N-末端含有的堿性磷酸酶在底物PNPP 存在時(shí)可以發(fā)生顏色變化的特性，可以對(duì)各野生型和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后所表達(dá)的AP -SEMA3 蛋白在特定波長(zhǎng)的吸光值進(jìn)行檢測(cè)以達(dá)到蛋白定量的目的。圖1 為同一AP-SEMA3 融合蛋白在不同稀釋比例下(2、4、10、20、50 及200 倍)的顯色結(jié)果，可見隨著稀釋比例的增加，顏色逐漸變淺，說(shuō)明光強(qiáng)度的變化與反應(yīng)體系中融合蛋白量的多少呈正相關(guān)。對(duì)上述稀釋倍數(shù)的AP-SEMA3C WT(野生型)和AP -SEMA3D WT 蛋白吸光值進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)(圖2)，稀釋比例過(guò)低時(shí)(如2 倍稀釋)可能存在光強(qiáng)度過(guò)飽和情況，導(dǎo)致吸光值檢測(cè)結(jié)果不隨時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，而稀釋比例過(guò)高時(shí)(如200 倍稀釋)，則光強(qiáng)度太弱而與陰性對(duì)照的區(qū)別大不。此外，為了除外各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率不同對(duì)目的蛋白表達(dá)可能產(chǎn)生的干擾作用，筆者還建立了一組AP-SEMA3 質(zhì)粒與FLAG -Hoxb7 質(zhì)粒雙轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，并對(duì)提取的HEK293T 細(xì)胞胞質(zhì)蛋白分別進(jìn)行FLAG-抗體和actin-抗體蛋白質(zhì)免疫印跡分析，結(jié)果顯示不同質(zhì)粒之間的轉(zhuǎn)染效率沒(méi)有明顯差異(結(jié)果未顯示)。

圖1 不同AP-SEMA3 融合蛋白稀釋比例下的顯色結(jié)果

圖2 AP-SEMA3C WT(野生型)和AP-SEMA3D WT融合蛋白在不同稀釋比例下的吸光度檢測(cè)結(jié)果

3.SEMA3C/SEMA3D 基因錯(cuò)義突變對(duì)Semaphorin 3 蛋白表達(dá)的影響:鑒于上述結(jié)果，筆者最終決定采用20 倍稀釋比例對(duì)轉(zhuǎn)染后HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)液上清及胞質(zhì)中的AP -SEMA3 融合蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。5 個(gè)錯(cuò)義突變中的4 個(gè)都會(huì)不同程度地影響相應(yīng)Semaphorin 3 蛋白的分泌和表達(dá)(培養(yǎng)液上清:SEMA3C S329G:0.95 ± 0.07，V337M:0.45 ± 0.02;SEMA3D H424Q:0.62 ± 0.05;SEMA3D V457I:0.87 ±0.04，P615T:1.02 ±0.08，n =5，one - way ANOVA，P ＜0.01;HEK293T 細(xì)胞胞質(zhì)提取物:SEMA3C S329G:1.06 ± 0.15，V337M:0.38 ± 0.04;SEMA3D H424Q:0.65 ± 0.15;SEMA3D V457I:0.60 ±0.12，P615T:0.78 ±0.19，n =3，one - way ANOVA，P ＜0.01 或P ＜0.05)，說(shuō)明即使是這些基因的點(diǎn)突變也可能會(huì)嚴(yán)重影響蛋白的表達(dá)量，從而妨礙蛋白功能的正常行使，詳見圖3、圖4。

圖3 野生型及突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的AP-SEMA3 融合蛋白定量檢測(cè)結(jié)果

圖4 野生型及突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞胞質(zhì)提取物中的AP-SEMA3 融合蛋白定量檢測(cè)結(jié)果

討 論

先天性巨結(jié)腸是一種與遺傳有關(guān)的多基因、多因素參與的復(fù)雜疾病，可散發(fā)，也可呈家族性遺傳。目前已經(jīng)鑒定的11 個(gè)HSCR 相關(guān)易感基因，主要來(lái)自于ENS 發(fā)育中起主要作用的2 個(gè)信號(hào)通路(RET、EDNRB)，以及可調(diào)控、影響這些基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因和其他幾個(gè)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中已明確具有重要作用的基因。組成ENS 的神經(jīng)細(xì)胞均來(lái)源于NCC，后者在胚胎期從神經(jīng)軸的兩個(gè)不同水平進(jìn)入腸道，稱為腸神經(jīng)嵴細(xì)胞(enteric neural crest cell，ENCC)，在腸間充質(zhì)中遷移、增殖、定居和分化，最終聚集成規(guī)律排列的神經(jīng)節(jié)并發(fā)出突起相互聯(lián)系，形成兩個(gè)重要的神經(jīng)叢，完成信號(hào)傳遞以及靶細(xì)胞的支配。這一發(fā)育過(guò)程具有嚴(yán)格的時(shí)間窗，不僅取決于ENCC 的內(nèi)部特質(zhì)，也受到腸道微環(huán)境中多種外部信號(hào)分子(主要是間葉組織細(xì)胞表達(dá)、分泌的蛋白)的引導(dǎo)和影響，缺一不可［12，13］。

對(duì)特定基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育期胚胎腸道內(nèi)一些蛋白的表達(dá)濃度和位置會(huì)顯著影響ENCC 的遷移路徑、聚集程度、空間定位和排列方式，從而可能在病理狀態(tài)下導(dǎo)致ENS 功能失常而顯現(xiàn)出與人類HSCR 相似的表型［14］。由此可見，對(duì)于先天性巨結(jié)腸的病因研究，需要從僅僅關(guān)注ENCC 的早期發(fā)育和變化過(guò)程轉(zhuǎn)移到腸道微環(huán)境對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成以及一些精細(xì)環(huán)節(jié)的調(diào)控機(jī)制上來(lái)，著眼于神經(jīng)元的定向遷移和成熟，神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)方向、誘導(dǎo)/抑制分子，靶細(xì)胞識(shí)別以及突觸的特異性建立等精細(xì)調(diào)控過(guò)程，為解釋本病的一系列特征性、復(fù)雜現(xiàn)象(例如疾病嚴(yán)重程度及臨床表現(xiàn)的差異和“非經(jīng)典遺傳方式”的表象等)拓展研究思路。

近期研究發(fā)現(xiàn)，新生兒正常腸段的肌間神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、腸道黏膜層和內(nèi)環(huán)、外縱兩層平滑肌內(nèi)都有SEMA3A 蛋白表達(dá)，而HSCR 患者無(wú)神經(jīng)節(jié)病變腸段平滑肌層內(nèi)的SEMA3A 表達(dá)量無(wú)論是與正常對(duì)照相比，還是與患者自身的正常腸段相比都有顯著增加，說(shuō)明該基因編碼的蛋白產(chǎn)物可能是本病的危險(xiǎn)因素之一［15］。選取中國(guó)東北地區(qū)119 例HSCR 患者和93 例正常對(duì)照進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析后發(fā)現(xiàn)，患者SEMA3A 基因內(nèi)的一個(gè)SNP risk allele(G allele)基因型頻率明顯高于對(duì)照組人群，說(shuō)明該基因可能顯著增加中國(guó)東北方人群的HSCR 患病風(fēng)險(xiǎn)［9］。最近報(bào)道的200 例西班牙HSCR 患者SEMA3A 和SEMA3D 基因的突變篩查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)有可能導(dǎo)致蛋白功能缺失的嚴(yán)重錯(cuò)義突變，進(jìn)一步免疫組化分析證實(shí)了其中3 個(gè)突變蛋白在患者病變腸段表達(dá)量的增加，也支持該類分子參與HSCR 發(fā)病的可能性［10］。

本研究在發(fā)現(xiàn)HSCR 患者攜帶的SEMA3C/SEMA3D 基因錯(cuò)義突變的基礎(chǔ)上，利用HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)、野生型和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以及通過(guò)測(cè)定吸光值定量檢測(cè)融合蛋白表達(dá)的方法，證實(shí)5 個(gè)突變中的4個(gè)都會(huì)不同程度地影響Semaphorin 3 蛋白的表達(dá)(以HEK293T 細(xì)胞胞質(zhì)提取物為檢測(cè)對(duì)象，代表已合成但是尚未分泌至胞外的融合蛋白)，而且其中3 個(gè)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相應(yīng)蛋白的分泌也顯著降低。與之相比，SEMA3C S329G 沒(méi)有引起任何Semaphorin 3 蛋白量的變化，提示該突變位點(diǎn)可能不具備病理意義，或者至少不是通過(guò)影響蛋白表達(dá)而在HSCR 發(fā)病中發(fā)揮作用。前已述及，胚胎發(fā)育過(guò)程中腸道微環(huán)境的某些分子表達(dá)位置和濃度梯度的變化可以通過(guò)影響ENCC 的遷移路徑、聚集程度、空間定位和排列方式參與ENS 發(fā)育的調(diào)控，Semaphorin 3 作為一類經(jīng)典的神經(jīng)元軸突導(dǎo)向因子，很可能在自身表達(dá)失衡(降低或升高)的情況下干擾ENS 的正常發(fā)育;另一方面，已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)HSCR 患者腸組織內(nèi)確實(shí)存在Semaphorin 3 蛋白表達(dá)失調(diào)的現(xiàn)象，提示該家族分子很可能在功能失常的情況下引發(fā)HSCR 缺陷表型。通過(guò)構(gòu)建蛋白質(zhì)模型發(fā)現(xiàn)，本研究中引起蛋白質(zhì)合成和分泌均減少的3 個(gè)突變(SEMA3C V337M;SEMA3D H424Q，V457I)都可能顯著降低蛋白穩(wěn)定性，從而可能由于突變蛋白降解量增加導(dǎo)致上述變化。至于SEMA3C S329G 是否可能干擾蛋白活性，以及SEMA3D P615T 合成量減少的原因，則需要進(jìn)一步開展功能實(shí)驗(yàn)予以探究。

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