劉穎坤， 蔡鈴瀟， 張愛蓮* ， 汪云珍， 包志泉， 嚴(yán)紅梅

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300;2. 臨安市林業(yè)局，浙江臨安311300;3. 建德市新安江林場，浙江 建德311600;4. 建德市壽昌林場，浙江 建德311612)

對(duì)葉百部為百部科植物對(duì)葉百部Stemona tuberosa Lour.的干燥塊根，分布于福建、臺(tái)灣、江西、湖北和云南等省市［1］，具有潤肺下氣、止咳和殺蟲的功效，為《中國藥典》2010 年版所收載百部藥材的3 個(gè)來源之一［2］。生物堿是百部的主要活性成分，具有良好的殺蟲、抗菌和鎮(zhèn)咳祛痰等作用［3］。目前，對(duì)葉百部總生物堿的定量測定研究很少，且局限于有機(jī)溶劑提?。?］。雙水相萃取(aqueous twophase extraction，ATPS)［5］能夠克服傳統(tǒng)提取分離的耗時(shí)長、工作量大和有機(jī)溶劑毒性大等缺點(diǎn)，是近年來引人注目的新型分離技術(shù)［6］。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法［7］，可用于確定各因素及其交互作用在工藝過程中對(duì)指標(biāo)(響應(yīng)值)的影響，精確地表述因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表達(dá)方面比以往推廣的正交設(shè)計(jì)法更加優(yōu)良［8］。

本實(shí)驗(yàn)采用雙水相體系提取，利用酸性染料比色法測定對(duì)葉百部總生物堿提取率［9］，通過響應(yīng)面優(yōu)化法考察有機(jī)物用量、無機(jī)鹽用量和料液比3 個(gè)因素對(duì)生物堿提取率的影響，確定最佳提取工藝，以期為對(duì)葉百部生物堿的生產(chǎn)開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

UV-2550 紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海島通應(yīng)用科技有限公司)，AB104-N 電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，SWB5200 型超聲清洗機(jī)(上海必能信超聲有限公司)，DGG-9070 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

對(duì)葉百部堿對(duì)照品(純度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)A0326)，溴甲酚綠(上海三愛思試劑有限公司)，0.05%溴甲酚綠緩沖液(自制，取0.2 mol/L 醋酸鈉70 mL 和0.2 mol/L 醋酸30 mL，配得pH 5.0 的緩沖液;取溴甲酚綠0.05 g，加入pH 5.0 的緩沖液100 mL，溶解，濾過，即得)，聚乙二醇1000 (PEG1000)(上海浦東高南化工廠)，無水醋酸鈉(溫州潤華化工實(shí)驗(yàn)公司)，硫酸鈉(湖州湖試化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為分析純。

百部藥材購買于浙江臨安錢王大藥房(按參考文獻(xiàn)［10］的方法對(duì)藥材進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明其為對(duì)葉百部)。將藥材置于50 ℃烘箱中烘干至恒定質(zhì)量，粉碎，過60目篩。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取對(duì)葉百部堿5.0 mg，甲醇定容至5 mL，制得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的對(duì)照品貯備液。取貯備液逐級(jí)稀釋，得質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 的系列對(duì)照品溶液。

分別精密吸取系列對(duì)照品溶液0.1 mL，置分液漏斗中，依次加入蒸餾水5 mL、0.05%溴甲酚綠緩沖液2 mL、三氯甲烷10 mL，振搖1 min，靜置1 h 后，取三氯甲烷層在417 nm 波長測定吸光度。另取0.1 mL 甲醇，同法操作，作為空白對(duì)照。以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程Y=1.570 45X-0.003 53，r2=0.999 1 (n=5)。實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)葉百部堿在0.1 ～0.8 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 對(duì)葉百部生物堿的提取與測定 精密稱取藥材0.5 g于錐形瓶中，按一定料液比加入雙水相體系溶液(PEG1000 溶液-Na2SO4溶液體積比3 ∶2)，超聲提取一定時(shí)間，抽濾，濾液置于分液漏斗靜置分層，取上層PEG1000 溶液，50 ℃減壓濃縮回收溶劑，用甲醇定容至10 mL，得供試液。按“2.1”項(xiàng)下操作測定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算出供試液中生物堿質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算得生物堿的提取率，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.3 單因素設(shè)計(jì)

2.3.1 Na2SO4用量比較 精密稱取5 份0.5 g 樣品，保持其他條件不變 (PEG1000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，超聲時(shí)間50 min，料液比為1 ∶30)，調(diào)整Na2SO4質(zhì)量濃度分別為0.25、0.3、0.35、0.4 和0.45 g/mL，按“2.2”項(xiàng)下方法檢測提取物中的生物堿提取率，重復(fù)3 次。

2.3.2 PEG1000 用量比較 精密稱取5 份0.5 g 樣品，保持其他條件不變(Na2SO4質(zhì)量濃度為0.35 g/mL，超聲時(shí)間50 min，料液比1 ∶30)，調(diào)整PEG1000 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%和50%，按“2.2”項(xiàng)下方法檢測提取物中的生物堿提取率，重復(fù)3 次。

2.3.3 料液比優(yōu)化 精密稱取5 份0.5 g 樣品，保持其他條件不變(Na2SO4質(zhì)量濃度0.35 g/mL，PEG1000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，超聲時(shí)間50 min)，調(diào)整料液比1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1 ∶50，按“2.2”項(xiàng)下方法檢測提取物中的生物堿提取率，重復(fù)3 次。

2.3.4 超聲時(shí)間比較 精密稱取5 份0.5 g 樣品，保持其他條件不變(Na2SO4質(zhì)量濃度0.35 g/mL，PEG1000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，料液比1 ∶30)，分別超聲10、20、30、40、50、60 min，按“2.2”項(xiàng)下方法檢測提取物中的生物堿提取率，重復(fù)3 次。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇PEG1000 用量、Na2SO4用量和料液比3 個(gè)因素，按照“2.2”項(xiàng)下操作測定提取物中對(duì)葉百部生物堿提取率，進(jìn)行3 因素3 水平共15 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(3 個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，使用Design-expert software 7.1.3 Trial 軟件 (美國)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，求出數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而得到最佳的提取工藝條件。

2.5 回流法提取百部中生物堿 精密稱取百部樣品粉末0.5 g，加15 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，回流時(shí)間1 h，提取溫度80 ℃。濾過，濾渣用少量提取試劑沖洗濾過，合并所有濾液，50 ℃減壓濃縮至干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，定容，搖勻，作為供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)操作，測定樣品中的生物堿提取率。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 Na2SO4用量對(duì)生物堿提取率的影響 從圖1 可以看出，隨著Na2SO4用量的增大，生物堿提取效率逐漸增加，在Na2SO4質(zhì)量濃度0.35 g/mL 時(shí)，生物堿提取率達(dá)到最高，之后生物堿提取率出現(xiàn)下降，故選擇Na2SO4用量在0.35 ～0.4 g/mL 為宜。

圖1 Na2SO4 用量對(duì)生物堿提取率的影響

3.1.2 PEG1000 用量對(duì)生物堿提取率的影響 從圖2 可以看出，隨著PEG1000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，生物堿提取率逐漸增加，在30%時(shí)，提取率達(dá)到最高，之后提取率出現(xiàn)下降，故選擇PEG1000 的用量在20% ～40%為宜。

3.1.3 料液比對(duì)生物堿提取率的影響 從圖3 可以看出，隨著料液比的增加，生物堿提取率隨之增加。在料液比1 ∶30 時(shí)，生物堿提取率達(dá)到最高，之后生物堿提取效率出現(xiàn)下降，故選擇料液比在1 ∶40 ～1 ∶20 為宜。

3.1.4 超聲時(shí)間對(duì)生物堿提取率的影響 隨著超聲時(shí)間的增加，生物堿提取率不斷增加，在40 min 前增加較為明顯;在50 min 時(shí)，生物堿含有量達(dá)到最高;50 min 后，生物堿提取率變化不大，趨近平行。觀察供試液發(fā)現(xiàn)，隨著提取時(shí)間的延長，色澤加深?？紤]到超聲時(shí)間過長，溫度會(huì)有所升高，可能對(duì)生物堿的結(jié)構(gòu)有一定的影響，且從縮短工時(shí)節(jié)省能源而得到較高的提取效率角度來考慮，選擇超聲時(shí)間50 min 為宜。

圖2 PEG1000 用量對(duì)生物堿提取率的影響

圖3 料液比對(duì)生物堿提取效率的影響

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化百部中生物堿提取工藝 對(duì)百部生物堿提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析的具體試驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。15 個(gè)試驗(yàn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，試驗(yàn)號(hào)1 ～12 是析因試驗(yàn)，13 ～15 是中心試驗(yàn)。其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維定點(diǎn)，零點(diǎn)區(qū)域?yàn)橹行狞c(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3 次，以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

采用Design Expert 7.1.6 軟件對(duì)中心組合試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析的結(jié)果見表2。以百部生物堿提取率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程

表2 RSM 分析擬合回歸方程的方差分析

響應(yīng)曲面圖和剖面圖是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子V、P、t所構(gòu)成的響應(yīng)面圖形，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用，剖面圖的形狀反映出兩因素交互作用的強(qiáng)弱，圖中等高線越趨向于橢圓，則反映出兩因素交互作用越強(qiáng)［11］。由圖4 ～圖6 可較為直觀地看出各因素對(duì)百部中生物堿提取效率的影響，曲線越陡峭，表明該因素對(duì)百部生物堿提取效率的影響越大，響應(yīng)值的變化亦愈大。由等值線圖可以看出存在極值的條件在圓心區(qū)域。對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)代入變換公式即得最佳提取條件PEG1000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)32.4%，Na2SO4質(zhì)量濃度0.353 g/mL，料液比1 ∶27.5，此條件下百部生物堿含有量預(yù)測值為9.09 mg/g。在此條件下進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到總生物堿含有量9.01 mg/g，與理論預(yù)測值吻合良好。

3.3 不同提取方法的比較 將本法與常規(guī)回流提取方法進(jìn)行比較研究，常規(guī)回流提取法提取百部中總生物堿含有量為7.21 mg/g，小于聚乙二醇1000 (PEG1000)/無水Na2SO4雙水相組合在最佳提取條件下對(duì)對(duì)葉百部的生物堿的提取率。結(jié)果表明，超聲耦合聚乙二醇 1000(PEG1000)/無水Na2SO4雙水相體系用于提取百部中的生物堿，不僅用時(shí)短，常溫下可進(jìn)行，避免了某些活性成分因高溫分解而損失，而且生物堿得率也高于常規(guī)方法，證明了超聲耦合雙水相體系的優(yōu)越性，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

圖4 硫酸鈉(A)與PEG1000 用量(B)對(duì)生物堿提取效率影響的曲面圖和剖面圖

圖5 硫酸鈉用量(A)與料液比(C)對(duì)生物堿提取效率影響的曲面圖和剖面圖

圖6 PEG1000 用量(B)與料液比(C)對(duì)生物堿提取率影響的曲面圖和剖面圖

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)考察了PEG1000 用量、Na2SO4用量、液料比和超聲時(shí)間對(duì)百部生物堿提取效率的影響，確定了進(jìn)一步試驗(yàn)的范圍，再應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)各因素的最佳水平范圍及其交互作用進(jìn)行研究和探討，建立了影響生物堿提取效率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，依據(jù)回歸分析結(jié)果可知，百部生物堿提取的最佳條件為PEG1000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)32.4%，Na2SO4質(zhì)量濃度0.353 g/mL，料液比1 ∶27.5。采用此優(yōu)化條件進(jìn)行提取試驗(yàn)，與理論預(yù)測值相符。

PEG1000/Na2SO4雙水相體系中，生物堿分配于上相有機(jī)相，而其他水溶性成分則分配于鹽水下相中，從而在提取的同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了生物堿與某些無效成分如糖類等的分離，有效提高了產(chǎn)物的純度。另外，在提取過程中，生物堿轉(zhuǎn)移至PEG1000 相，可改變提取過程中的化學(xué)平衡，有利于更多生物堿的溶出。實(shí)驗(yàn)研究表明，與傳統(tǒng)的加熱回流法相比，超聲輔助提取與PEG1000/Na2SO4雙水相體系可方便實(shí)現(xiàn)集成，并能縮短提取時(shí)間、提高效率，降低提取溫度，避免了某些活性成分因高溫分解而損失，從而獲得了高純度和活性的生物堿。該提取工藝在百部活性成分的提取分離方面展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。

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