程 玥， 張 雪， 陳淑嫻， 張曉雙， 劉繼平*

(1. 陜西中醫(yī)藥大學藥理實驗中心，陜西 咸陽712046;2. 陜西中醫(yī)藥大學中藥藥理實驗室，陜西 咸陽712046)

血管性癡呆(VD)是老年癡呆的常見類型之一，是由一系列腦血管疾病導致腦組織損害所致的嚴重認知功能障礙綜合征，以記憶、認知功能缺損為主要表現(xiàn)，可伴有語言、運動及人格障礙等［1-4］。我國65 歲以上的老年人癡呆發(fā)病率逐漸增高，其中血管性癡呆僅次于阿爾茲海默病，排第二位［5］，現(xiàn)代醫(yī)學對血管性癡呆的治療主要在嚴格控制、積極防治血管性癡呆危險因素的基礎上，采用改善腦循環(huán)及促智力藥物、腦代謝激活劑、抗膽堿酯酶藥物、腦血管擴張劑、抗自由基藥物等方面的藥物，上述藥物均有其局限性，近年來醫(yī)家嘗試中醫(yī)藥用于血管性癡呆的治療，取得了很好的療效，為了進一步開發(fā)治療血管性癡呆的新型藥物，相關領域的基礎研究顯得十分必要［6-8］。本課題組在前期文獻及實驗研究的基礎上，通過對明代張景岳的名方七福飲改善認知障礙及神經病理改變的作用及其作用機制進行研究，為本方的臨床應用提供進一步的科學依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 七福飲水煎液(100%)，自制，方劑組成為人參、熟地、當歸、白術(炒)、炙甘草、酸棗仁和遠志(制用)，以上藥材均購自咸陽天天樂醫(yī)藥超市;膽堿酯酶(CHE)試劑盒，批號20131203;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，批號20131128;丙二醛(MDA)試劑盒，批號20131126;谷胱甘肽過氧化物歧化酶(GSH-PX)試劑盒，批號20131121;考馬斯亮蘭蛋白試劑盒，批號20131202，均購自于南京建成生物工程研究所;Bcl-2、Bax免疫組化試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器 Morris 水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司);DMBH200 顯微鏡(舜宇光學科技有限公司);Thermo-86度低溫冰箱;BT224S 電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);微量移液器(上海求精生化試劑儀器有限公司);752 紫外分光光度計。

1.3 動物 清潔級雄性SD 大鼠，體質量250 ～300 g，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK (軍)2012-006。動物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學藥理實驗中心，保持12 h 晝夜節(jié)律，室溫(22 ±1)℃，自由攝食飲水。

2 方法

2.1 造模與分組 參考文獻［9］方法采用雙側頸總動脈結扎的方法制作VD 模型。具體方法如下:所有大鼠禁食不禁水8 h 后腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg 麻醉，頸部皮膚去毛后進行消毒并在正中切口，鈍性分離出雙側頸總動脈，假手術組大鼠的雙側頸總動脈不結扎只分離，進行皮膚縫合;其余大鼠以“4”號絲線雙重結扎其雙側頸總動脈并從中間剪斷動脈。術后連續(xù)5 d 肌注慶大霉素5 mg/kg。1 個月后，大鼠按體質量隨機分為假手術組、模型組、七福飲低、高劑量組，開始灌胃，七福飲低、高劑量組分別灌服100%七福飲水煎液，劑量分別為2.15 g/kg、4.3 g/kg;假手術組和模型組均給予等容量生理鹽水灌胃，每天1 次，共30 d。

2.2 Morris 水迷宮實驗 第30 天灌胃1 h 后，每組隨機取大鼠10 只，連續(xù)4 d 對大鼠進行訓練，每天分兩個時間段(上午、下午)，每個時間段分別從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 個象限的正中位置將大鼠面向池壁投入水中，記錄大鼠120 s內潛伏期以及搜索距離，如果大鼠在120 s 內還沒有找到平臺，將大鼠用棍子引導至平臺，在平臺停留20 s 后取出，潛伏期以120 s 計算。于第5 天撤除平臺，隨機選取1個象限的正中位置將大鼠面向池壁投入水中，記錄大鼠120 s 內跨過虛擬平臺的穿越次數(shù)及大鼠在原站臺Ⅱ象限(目標象限)的游泳時間。

2.3 取材與標本處理 水迷宮實驗結束后，每組隨機取4只大鼠，麻醉后，4%多聚甲醛0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.4)心內灌注固定，待固定充分后，開顱取腦，冠狀位取視交叉向尾端3 ～4 mm 組織塊，投入相同固定液于4 ℃固定1 周后，常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片，進行HE 染色、Bax、Bcl-2 免疫組化染色;Bax、Bcl-2 每個指標選取切片于40 倍顯微鏡下，運用IBM 攝像系統(tǒng)進行采圖，各組選取海馬部位共8 個不重復視野，用顯微生物圖像分析系統(tǒng)對所采集圖像進行病理圖像分析，統(tǒng)一光飽和度、亮度和色調，測量平均灰度值。

每組剩余大鼠處死取腦，迅速放入冰冷的生理鹽水中進行漂洗，濾紙吸干水分后進行海馬組織的分離并稱定質量，在冰浴下用勻漿器勻漿，制成質量體積比為10%的組織勻漿，3 500 r/min 離心10 min，取上清液，凍存，備用，按照試劑盒說明測定SOD、MDA、GSH-PX 和CHE 各項指標。

3 結果

3.1 對血管癡呆模型大鼠水迷宮實驗成績的影響 水迷宮實驗第1 天各組間潛伏期、探索距離基本無顯著性差異，第2 天起，與假手術組比較，模型組的逃避潛伏期、探索距離顯著延長(P ＜0.01 或P ＜0.05)，目標象限游泳時間明顯縮短、站臺穿越次數(shù)明顯減少(P ＜0.01);與模型組相比，假手術組、七福飲低、高劑量組逃避潛伏期、探索距離明顯縮短(P ＜0.05 或P ＜0.01)，目標象限(II 象限)的游泳時間明顯延長(P ＜0.01)，站臺穿越次數(shù)增多(P ＜0.01)(見表1 ～表3，圖1)。

表1 七福飲對血管癡呆模型大鼠水迷宮試驗潛伏期的影響(±s，n=10)

表1 七福飲對血管癡呆模型大鼠水迷宮試驗潛伏期的影響(±s，n=10)

注:與假手術組比較，△△P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg -1) 潛伏期/s 1 d 2 d 3 d 4 d假手術組 — 73.20 ±41.61 58.45 ±45.55 38.02 ±43.14 26.89 ±34.24模型組 — 119.36 ±0.50 106.02 ±34.71△△ 98.03 ±36.26△△ 97.86 ±35.38△△七福飲低劑量組 2.15 94.11 ±39.15 76.81 ±40.09 64.16 ±45.55▲ 60.29 ±43.60▲七福飲高劑量組 4.3 89.04 ±47.09 56.35 ±33.48▲▲ 51.75 ±23.90▲▲ 50.18 ±25.21▲▲

表2 七福飲對血管癡呆模型大鼠水迷宮試驗探索距離的影響(±s，n=10)

表2 七福飲對血管癡呆模型大鼠水迷宮試驗探索距離的影響(±s，n=10)

注:與假手術組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg -1) 探索距離/m 1 d 2 d 3 d 4 d假手術組 — 15.72 ±11.46 11.55 ±12.16 7.93 ±10.64 4.93 ±7.69模型組 — 22.56 ±8.45 21.86 ±11.03△ 23.87 ±15.75△△ 24.01 ±15.28△△七福飲低劑量組 2.15 19.66 ±11.16 13.78 ±8.90 10.96 ±49.34▲ 12.37 ±11.49▲七福飲高劑量組 4.3 18.19 ±11.22 10.11 ±6.17▲▲ 11.16 ±7.82▲ 8.80 ±5.44▲

表3 七福飲對血管癡呆大鼠水迷宮試驗目標象限時間和穿越次數(shù)的影響(±s，n=10)

表3 七福飲對血管癡呆大鼠水迷宮試驗目標象限時間和穿越次數(shù)的影響(±s，n=10)

注:與假手術組比較，△△P ＜0.01;與模型組比較，▲▲P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg -1)II 象限時間/%站臺穿越次數(shù)/次33.38 ±15.76 3.20 ±1.23模型組 — 12.47 ±6.42△△ 0.43 ±0.79△△七福飲低劑量組 2.15 26.66 ±6.16▲▲ 2.57 ±0.98▲▲七福飲高劑量組 4.3 31.16 ±11.1▲▲ 2.86 ±0.90假手術組 —▲▲

3.2 對血管癡呆模型大鼠海馬組織SOD、MDA、GSH-PX活性明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，CHE 活性和MDA水平顯著升高(P ＜0.05);與模型組比較，七福飲低、高劑量組SOD、GSH-PX 活性顯著升高 (P ＜0.01 或P ＜0.05)，MDA 低劑量組水平顯著性降低(P ＜0.05)，CHE活性無顯著性差異，見表4。

3.3 對大鼠海馬組織病理改變的影響 HE 染色結果顯示，假手術組大鼠海馬區(qū)神經元排列規(guī)則，胞質豐富，胞核較大。模型組大鼠海馬神經元大量變性、死亡，細胞體積縮小，周圍出現(xiàn)空暈，呈深紅色染色，核固縮，破裂明顯。七福飲與模型組比較，海馬區(qū)神經元變性死亡明顯減輕，海馬區(qū)神經元胞體縮小，但形狀與假手術組接近，見圖2。

圖1 七福飲對血管癡呆模型大鼠Morris 水迷宮游泳軌跡的影響

表4 七福飲對血管癡呆大鼠海馬組織SOD、MDA、GSH-PX 和CHE 的影響(±s，n=10)

表4 七福飲對血管癡呆大鼠海馬組織SOD、MDA、GSH-PX 和CHE 的影響(±s，n=10)

注:與假手術組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg -1) SOD/(U·mg port -1) MDA/(nmol·mg port -1) GSH-PX/(U·mg port -1) CHE/(U·mg port -1)假手術組 — 15.22 ±3.68 41.76 ±10.25 140.15 ±31.81 18.84 ±4.28模型組 — 10.85 ±1.50△ 59.87 ±6.58△ 104.81 ±4.21△△ 44.25 ±18.19△七福飲低劑量組 2.15 15.9 ±3.54▲ 46.98 ±9.88▲ 153.11 ±26.97▲▲ 32.15 ±10.60七福飲高劑量組 4.3 16.37 ±1.98▲▲ 38.61 ±20.42 166.91 ±16.24▲▲25.94 ±9.87

圖2 七福飲對血管癡呆模型大鼠HE 染色的影響

免疫組化染色顯示，與假手術組比較，模型組Bax 免疫陽性細胞數(shù)明顯增多，著色明顯加深，平均灰度值明顯降低(P ＜0.01);與模型組比較，七福飲高、低劑量組Bax 免疫陽性細胞數(shù)明顯降低，著色較淺，與假手術組接近，平均灰度值明顯升高(P ＜0.01 或P ＜0.05)，見圖3、圖4、表5。與假手術組比較，模型組Bcl-2 免疫陽性細胞數(shù)明顯減少，著色偏淡，平均灰度值明顯升高 (P ＜0.01);與模型組比較，七福飲各劑量組Bcl-2 免疫陽性細胞數(shù)明顯增多，著色明顯加深，與假手術組接近，平均灰度值明顯降低(P ＜0.05)。

圖3 七福飲對血管癡呆模型大鼠海馬組織凋亡的影響(Bax 染色)

圖4 七福飲對血管癡呆模型大鼠海馬組織凋亡的影響(Bcl-2 染色)

表5 七福飲對血管癡呆模型大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2表達平均灰度值的影響(±s)

表5 七福飲對血管癡呆模型大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2表達平均灰度值的影響(±s)

注:與假手術組比較，△△P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg -1)Bax 平均灰度值 Bcl-2平均灰度值假手術組 —135.90 ±10.70 122.01 ±1.23模型組 — 104.61 ±7.76△△ 156.46 ±9.28△△七福飲低劑量組 2.15 117.70 ±7.01▲ 146.07 ±8.71七福飲高劑量組 4.3 121.43 ±7.70▲▲ 141.43 ±7.89▲

3 討論

由于大腦組織缺血缺氧，導致智力、記憶力進行性衰退，學習記憶障礙是血管性癡呆患者普遍而嚴重的表現(xiàn)［10］。通過水迷宮進行大鼠神經認知模型的驗證和神經認識治療可行性的評估［11-12］，大鼠逃避時間、摸索距離越短，穿越次數(shù)、目標象限活動時間越長，提示大鼠學習記憶能力越強。水迷宮實驗結果提示，七福飲能減少大鼠逃避潛伏期和摸索距離，增加穿越次數(shù)和目標象限活動時間，表明七福飲可明顯改善血管性癡呆大鼠的學習記憶能力。

血管性癡呆病人大腦皮層和海馬中的病理改變主要為皮質彌漫性萎縮，溝回增寬，腦室擴大，神經元大量減少，神經原纖維結等病變，以乙酰膽堿(Ach)及膽堿乙酰化酶的含量顯著減少為典型生理表現(xiàn)，乙酰膽堿由膽堿酯酶分解，海馬組織中膽堿酯酶水平增加，加快Ach 的水解，Ach 水平減少［13］，所以穩(wěn)定體內乙酰膽堿含量，為治療和改善老年癡呆癥的一條有效途徑。與模型組比較，七福飲能抑制膽堿酯酶的活性，減少Ach 的水解，但沒有顯著性差異。

機體內氧自由基的含有量過多可引起組織過氧化損傷，這也是產生血管性癡呆的重要原因之一，清除過多的自由基可以延緩癡呆患者的病情惡化［14］。MDA 是脂類過氧化生成物，會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細胞毒性。SOD、GSH-PX 是體內的抗氧化系統(tǒng)，能及時修復受損細胞，減少因氧自由基對細胞造成的損害。七福飲可顯著減少血管性癡呆模型大鼠MDA 的生成，提高SOD、GSH-PX 活力，提示七福飲具有較好的抗氧化能力。

血管性癡呆發(fā)病時，海馬神經細胞存在細胞凋亡，而Bcl-2 家族是細胞凋亡機制中重要的調節(jié)因子，該基因是抗細胞凋亡基因，Bax 基因是促細胞凋亡基因，本研究表明七福飲能夠減少血管性癡呆大鼠海馬組織的Bax 陽性表達，增加Bcl-2 陽性表達，能夠抑制海馬組織神經元的凋亡，進而改善血管性癡呆模型大鼠的學習記憶功能。

綜上所述，七福飲對血管性癡呆大鼠的記憶障礙有改善作用，能明顯減少大鼠在水迷宮試驗中的逃避潛伏期和探索距離，增加穿越次數(shù)和目標象限活動時間;可提高SOD、GSH-PX 活性，減少MDA 水平，降低CHE 的活性，能夠減少VD 大鼠海馬組織的Bax 表達，增加Bcl-2 表達，以上研究結果可為臨床治療提供參考依據(jù)。

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