郭占鵬， 劉 堃， 黃米娜， 王巖松， 袁亞江， 郭 躍， 劉安琪， 梅晰凡*

(1. 遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州121001;2. 遼寧醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，遼寧錦州121001;3. 遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001)

在以往的研究中發(fā)現(xiàn)肌源性干細(xì)胞有向軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞分化的潛能［1-2］。相關(guān)研究和臨床實(shí)踐證明，補(bǔ)陽還五湯可以改善脊髓損傷后大鼠的功能［3］。因此推斷是否補(bǔ)陽還五湯具有通過調(diào)節(jié)微環(huán)境促進(jìn)多潛能干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的可能。據(jù)此將體外培養(yǎng)的肌源性干細(xì)胞分為對照組及補(bǔ)陽還五湯含藥血清組，研究補(bǔ)陽還五湯對肌源性干細(xì)胞體外生長分化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 清潔級SD 大鼠，體質(zhì)量(100 ±5)g，雌雄不限，隨機(jī)分為對照血清組和藥物血清組，各30 只。所有大鼠均由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號SCXK ［遼］2003-2007)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑及儀器 補(bǔ)陽還五湯由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁(飲片)組成，各成分比例為20 ∶3 ∶3 ∶3 ∶3 ∶2 ∶3。生藥由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥劑科一次性購買后水煎2 次，合藥后濃縮至0.8 g/mL，過濾除菌后分袋包裝，冷凍保存?zhèn)溆?。Ⅱ型膠原酶(Sigma);Ⅱ型分散酶(Sigma);高糖DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司);兔抗大鼠Desmin、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體購自北京中杉金橋公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清制備 藥物血清組大鼠每日灌服濃縮中藥湯劑4 mL/次，藥物劑量按照3 g/kg (劑量按照成人體表面積的2 倍計(jì)算)，早晚各1 次，連續(xù)給藥3 d，對照血清組每天灌服相同劑量生理鹽水。末次給藥4 ～6 h 內(nèi)采尾血2 mL，靜置3 h 后離心分離血清，56 ℃滅活30 min，-20 ℃冷凍備用。

1.2.2 原代MDSCs 的分離純化培養(yǎng) 無菌條件下取新生1 ～3 d 的SD 乳鼠四肢肌肉組織，剔除脂肪、肌腱等組織后應(yīng)用混合酶(含有Ⅱ型膠原酶2 g/L、Ⅱ型分散酶4.8 g/L、CaCl20.28 g)消化約60 min 后終止消化，經(jīng)過濾離心后去上清，加入DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶中，采用差速貼壁法分離純化肌源性干細(xì)胞，細(xì)胞在達(dá)到約70% ～80%匯合時(shí)傳代培養(yǎng)。

取傳代后生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，載入24 孔板(約1 ×104細(xì)胞)，隨機(jī)分為2 組(對照血清組和含藥血清組)，每組10 孔，每孔加入培養(yǎng)液1 mL，37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)7 d。倒置相差顯微鏡下觀察2 組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3 免疫熒光法檢測 在含有細(xì)胞懸液的培養(yǎng)皿中放入蓋玻片，將培養(yǎng)皿放入5%CO2培養(yǎng)箱，每天換液，培養(yǎng)2 ～3 d，多聚甲醛(4%)固定25 ～30 min;Triton -100(0.3%)作用5 min，H2O2(3%)作用20 ～30 min;加封閉液20 min，去除多余液體，不需漂洗，滴加一抗4 ℃過夜;繼續(xù)滴加二抗(1 ∶100 稀釋)作用2 h;SABC 30 min;DAB 試劑盒顯色作用30 min;蘇木素染色0.5 min;梯度酒精(75% →85% →95% →100%)脫水，脫水時(shí)間4 min/次。二甲苯Ⅰ滴定10 min，二甲苯Ⅱ滴定10 min。緩沖甘油封片，無熒光指甲油封4 周。

1.2.4 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 采集肌源性干細(xì)胞和分化的神經(jīng)樣細(xì)胞，采用2 ∶1 的裂解液 (RIPA + 1%PMSF)裂解充分，4 ℃條件下12 000 r/min 離心20 min。以牛血清白蛋白(BSA)為對照 品，用BCA 法測定蛋白質(zhì)含有量，按得出的蛋白量(蛋白樣品TBS、RSB)加入無菌EP 管，加樣，沸水煮4 min，降溫后放入-20 ℃冰箱，保存試驗(yàn)備用。

采用經(jīng)典SDS-PAGE 法(12%)分離蛋白質(zhì)，每個(gè)點(diǎn)樣孔的蛋白上樣量為20 μg。凝膠電泳結(jié)束后將PAGE 膠體中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，將膜放入3%(m/V)BSA 阻斷緩沖液中，封閉條件60 min，用TBS 緩沖液(10 mmol/L Tris (pH 8.0)、150 mmol/L NaCl)洗膜3次，清洗條件10 min/次。將膜放入兔抗大鼠Hes1 一抗中(抗體1 ∶500 稀釋)，4 ℃過夜。TTBS (含0.05% Tween 20)緩沖液低溫沖洗3 次后，室溫條件下將膜放入含有辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗中孵育1 ～2 h，繼續(xù)用TTBS［1 L TBS 緩沖液中加入0.5 mL Tween 20 (0.05%)］洗膜3 次，清洗條件5 min/次，TTBS 沖洗后，將膜放入二抗中，室溫?fù)u床上孵育1 h，再用TTBS 洗膜3 次/5 min 后，倒掉洗膜液，甩去多余液體，轉(zhuǎn)膜時(shí)與膠相鄰的一面向上鋪于玻璃板上。將ECL 試劑盒內(nèi)的detection reagent 1 與detection reagent 2 等體積混合后，均勻滴在PVDF 膜上，反應(yīng)1 ～2 min，上機(jī)檢測。

表達(dá)相對水平=［(實(shí)測灰度值/β -actin)/(對照組灰度值/β-actin)的均數(shù)］×100%

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)7 d 后，兩組細(xì)胞均貼壁生長，狀態(tài)良好。對照血清組細(xì)胞與分離純化后細(xì)胞相似，多數(shù)呈紡錘狀或梭形生長。含藥血清組細(xì)胞胞漿出現(xiàn)長突起，類似神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)突起，細(xì)胞突起間相互融合，但是并未出現(xiàn)典型的神經(jīng)球(圖1)。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2 免疫熒光檢測 NSE 和GFAP 在對照血清組細(xì)胞胞漿內(nèi)可見少量表達(dá)，而其在含藥血清組細(xì)胞內(nèi)可見高表達(dá)(圖2)。

圖2 免疫熒光檢測圖

結(jié)果可知，NSE 在對照血清組細(xì)胞胞漿可見少量表達(dá);NSE 在含藥血清組細(xì)胞內(nèi)可見高表達(dá);GFAP 在對照血清組細(xì)胞胞漿可見少量表達(dá);GFAP 在含藥血清組細(xì)胞內(nèi)可見高表達(dá)(×400)。

2.3 蛋白表達(dá)水平分析 NSE 和GFAP 蛋白在對照血清組細(xì)胞內(nèi)可見少量表達(dá)，而其在含藥血清組細(xì)胞內(nèi)可見強(qiáng)表達(dá)，二者均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)(圖3)。

圖3 NSE 和GFAP 蛋白在對照血清組和含藥血清組細(xì)胞中表達(dá)水平變化

3 討論

根據(jù)脊髓損傷后出現(xiàn)的癥狀與中醫(yī)古籍中對“體惰、痿病”的描述相類似。督脈受損則經(jīng)氣不通、氣血阻滯，導(dǎo)致陽氣不能通達(dá)四肢，從而出現(xiàn)肢體麻木、癱瘓、二便失禁等經(jīng)絡(luò)不通的現(xiàn)象;同時(shí)督脈貫脊、絡(luò)腎，故督脈受損必傷及腎。補(bǔ)陽還五湯是由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁熬制而成的湯藥。黃芪意在大補(bǔ)元?dú)?、使氣旺血行，赤芍、桃紅活血化瘀，地龍、川芎通絡(luò)止痙，當(dāng)歸補(bǔ)血活血［4］。研究表明:補(bǔ)陽還五湯對脊髓缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其可能抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［5］。另有研究發(fā)現(xiàn):補(bǔ)陽還五湯能夠促進(jìn)大鼠脊髓損傷后移植的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖和遷移［6］。大量的研究均表明補(bǔ)陽還五湯對脊髓損傷修復(fù)具有一定的積極作用，而經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)肌源性干細(xì)胞(muscle derived stem cells，MDSCs)，又稱為群旁細(xì)胞(side populations，SP)，具有多向分化潛能，良好的增殖和自我更新能力，體外分化為神經(jīng)細(xì)胞、骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞［7-11］等系的細(xì)胞，能夠?qū)崿F(xiàn)離體分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增，且來源豐富、方便，具有良好的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)能力。郭占鵬等［12-13］通過實(shí)驗(yàn)證明肌源性干細(xì)胞在一定作用下可體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞。因此本次研究側(cè)重于通過實(shí)驗(yàn)觀察補(bǔ)陽還五湯對大鼠肌源性干細(xì)胞體外生長分化的影響。

神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)被視為經(jīng)典的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)記［14］。本次研究通過對含藥血清組和對照組兩組中NSE、GFAP 的表達(dá)進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)藥物血清組的細(xì)胞可見多邊形改變類似神經(jīng)樣突起，對照組細(xì)胞呈紡錘狀;藥物血清組中細(xì)胞的NSE 和GFAP 的表達(dá)均明顯高于對照組(P ＜0.05)。通過實(shí)驗(yàn)觀察到含藥血清組使肌源性干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，其細(xì)胞形態(tài)改變出現(xiàn)類似神經(jīng)樣突起，而對照組無此變化。因此認(rèn)為補(bǔ)陽還五湯對大鼠肌源性干細(xì)胞體外生長分化具有一定促進(jìn)作用，能夠在一定程度上促進(jìn)肌源性干細(xì)胞的分化。

本實(shí)驗(yàn)采用補(bǔ)陽還五湯對肌源性干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化成神經(jīng)樣細(xì)胞，獲得了滿意的分化效果，充分說明補(bǔ)陽還五湯作為中藥湯劑在適當(dāng)?shù)臈l件下是可以促進(jìn)體內(nèi)神經(jīng)樣細(xì)胞的形成，這也為脊髓損傷細(xì)胞移植中藥輔助治療提供了一定理論基礎(chǔ)。但由于中藥湯劑成分比較復(fù)雜，其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

［1］ 李全雙，梅晰凡，郭占鵬，等. 成肌干細(xì)胞在透明質(zhì)酸凝膠載體中誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的研究［J］. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010，35(7):829-832.

［2］ Huang M N，Guo Z P，Liu K，et al. Protein hairy enhancer of split-1 expression during differentiation of muscle-derived stem cells into neuron-like cells［J］. Neural Regen Res，2012，7(28):2182-2187.

［3］ Chen A，Wang H，Zhang J. BYHWD rescues axotomized neurons and promotes functional recovery after spinal cord injury in rats［J］. J Ethnopharmacol，2008，117(3):451-456.

［4］ Fan L，Wang K，Cheng B. Effects of buyang huanwu decoction on apoptosis of nervous cells and expressions of Bcl-2 and bax in the spinal cord of ischemia-reperfusion injury in rabbits［J］. J Tradit Chin Med，2006，26(2):153-156.

［5］ Wang L，Jiang D M. Neuroprotective effect of Buyang Huanwu Decoction on spinal ischemia/reperfusion injury in rats［J］. J Ethnopharmacol，2009，124(2):219-223.

［6］ 張 敏，柴 勇，楊 成，等. 補(bǔ)陽還五湯對大鼠脊髓損傷后移植神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖與遷移的影響［J］. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2011，27(3):326-330.

［7］ Danisovic L，Varga I，Polák S，et al. Biological and morphological characterization of in vitro expanded human muscle-derived stem cells［J］. Tsitologiia，2011，53(6):482-487.

［8］ Nieponice A，Soletti L，Guan J，et al. Development of a tissueengineered vascular graft combining a biodegradable scaffold，muscle-derived stem cells and a rotational vacuum seeding technique［J］. Biomaterials，2008，29(7):825-833.

［9］ Zhang Y，Lian J B，Stein J L，et al. The Notch-responsive transcription factor Hes-1 attenuates osteocalcin promoter activity in osteoblastic cells［J］. J Cell Biochem，2009，108(3):651-659.

［10］ Baek Y S，Kang S H，Park J S，et al. Long-term cultured skeletal muscle-derived neural precursor cells and their neurogenic potentials［J］. Neuroreport，2009，20(12):1109-1114.

［11］ Rc'h P，Romero-Ramos M，Chivatakarn O，et al. Isolation and characterization of cells with neurogenic potential from adult skeletal muscle［J］. Biochem Biophys Res Commun，2004，317(3):893-901.

［12］ 郭占鵬，梅晰凡，袁亞江，等. Detlal 基因在肌源性干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞過程中的表達(dá)［J］. 解剖學(xué)雜志。2011，34(5):641-643.

［13］ 郭占鵬，梅晰凡，李全雙，等. Jagged1 蛋白在肌源性干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞過程中的表達(dá)差異［J］. 遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30(5):389-391.

［14］ Buas M F，Kabak S，Kadesch T. Inhibition of myogenesis by Notch:evidence for multiple pathways［J］. J Cell Physiol，2009，218(1):84-93.