郭美仙， 施貴榮， 陳俊雅， 沈 磊， 劉曉波

(大理大學(xué)藥物研究所，云南 大理671000)

酒精性肝病是由于長(zhǎng)期大量飲酒所致的慢性疾病，初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化，嚴(yán)重時(shí)甚至可誘發(fā)肝細(xì)胞壞死及肝功能衰竭［1］。酒精性肝損傷的發(fā)病比較復(fù)雜，氧化應(yīng)激是公認(rèn)的機(jī)制之一［2］。因此，抗氧化療法已成為酒精性肝病治療的研究重點(diǎn)。紫茉莉Mirabilis jalapa L. 為紫茉莉科紫茉莉?qū)僦参?，俗名夜晚花、粉豆花等?-4］。根及全草入藥，可治療扁桃體炎、前列腺炎、乳腺炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、泌尿系感染等［5］?，F(xiàn)代研究表明紫茉莉中具有抗氧化作用的有效成分——黃酮［6-7］。宋粉云等［8］研究發(fā)現(xiàn)紫茉莉中含有葫蘆巴堿，葫蘆巴堿具有抗腫瘤活性。陳潤(rùn)生等［9］研究表明紫茉莉有抗病毒作用。趙錦慧等［10］研究表明紫茉莉有抗菌作用。國(guó)內(nèi)外尚未見紫茉莉?qū)凭愿螕p傷防治作用的研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究了紫茉莉含藥血清對(duì)乙醇損傷L-02 肝細(xì)胞的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 L-02 肝細(xì)胞，購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物 SD 大鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量180 ～200 g。由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (滇)2011-0004。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.3 樣品 云南大理蒼山采樣，經(jīng)本院生藥學(xué)副教授張德全鑒定為紫茉莉?qū)僦参镒宪岳騇irabilis jalapa L.。取干燥紫茉莉全草粗粉5 kg，用95%乙醇(50 ～52 ℃)回流抽提，濾去不溶物，蒸餾回收乙醇，濃縮得浸膏357 g (1 g浸膏相當(dāng)于14 g 生藥)，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。用時(shí)生理鹽水配成4%混懸液［11］。

1.4 藥品與試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)液(Gibco 公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);MTT 和DMSO(Sigma 公司);0.25% 胰蛋白酶和1% 雙抗 (Amresc 公司);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)試盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)試盒、超氧化物岐化酶測(cè)試盒、丙二醛測(cè)試盒和總蛋白測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.5 儀器 3-111 型培養(yǎng)箱(Thermo 公司);SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái);AE-21 型倒置顯微鏡(MOTIC 公司);Synergy HT 多功能酶標(biāo)儀(BIO-Tek 公司)。

2 方法

2.1 含藥血清制備 取大鼠10 只，隨機(jī)分為生理鹽水組和紫茉莉浸膏組，每組5 只。禁食不禁水12 h 后，各組按10 mL/kg灌胃(通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，獲得最佳劑量)相應(yīng)藥物，每天早晚各1 次，共3 d。于末次灌胃后1 h，用乙醚麻醉動(dòng)物，在無(wú)菌條件下，由腹主動(dòng)脈采血，血液采出后靜置30 min，離心(3 000 r/min)15 min，分離血清，將同組大鼠血清混勻，56 ℃水浴30 min 滅活血清，滅活后于超凈工作臺(tái)內(nèi)用微孔濾膜過濾除菌，除菌后的血清即紫茉莉含藥血清(以下簡(jiǎn)稱“含藥血清”)，-80 ℃冰箱保存［12］。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將L-02 肝細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗，并不含Hepes 的RPMI-1640 培養(yǎng)液(以下簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)液”)中。

2.3 確定建立肝細(xì)胞損傷模型的最佳乙醇濃度 將存活率大于90%的L-02 肝細(xì)胞用“完全培養(yǎng)液”配制成1 ×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板(90 μL/孔)，設(shè)調(diào)零組(加入“完全培養(yǎng)液”)、正常組、不同濃度乙醇組，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。48 h 后，已有80%的細(xì)胞貼壁，調(diào)零組和正常組加入“完全培養(yǎng)液”，乙醇1、2、3、4 組分別加入濃度為25、50、100、200 mmol/L 的乙醇(用“完全培養(yǎng)液”配制)，各孔10 μL。繼續(xù)培養(yǎng)8 h 后，去培養(yǎng)液，所有孔加入5 mg/mL MTT (100 μL/孔)，37 ℃孵育4 h，去上清液，所有孔加入“三聯(lián)液”(10% SDS-5% 異丁醇-0.12% HCl)200 μL/孔，570 nm 處檢測(cè)吸光度(A)。實(shí)驗(yàn)孔實(shí)際A 值=實(shí)驗(yàn)孔實(shí)測(cè)A 值-調(diào)零孔A 值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算不同乙醇濃度下肝細(xì)胞存活率，選擇細(xì)胞存活率約50%時(shí)的乙醇濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度［13-14］。

2.4 含藥血清對(duì)乙醇損傷L-02 肝細(xì)胞存活率的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且存活率大于90%的L-02 肝細(xì)胞，用“完全培養(yǎng)液”配制成1 ×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于96孔板(90 μL/孔)，設(shè)調(diào)零組(加入“完全培養(yǎng)液”)、正常組、陰性組、3 個(gè)不同質(zhì)量濃度血清組，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。48 h 后80%的細(xì)胞已貼壁，調(diào)零組和正常組加入“完全培養(yǎng)液”，陰性組加入“含生理鹽水血清”，血清1、2、3 組分別依次加入體積分?jǐn)?shù)為25%、50%、100%的“含藥血清”對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)防處理，各孔10 μL;1 h 后，調(diào)零組和正常組加入“完全培養(yǎng)液”，陰性組和血清組加入100 mmol/L 乙醇，各孔10 μL。繼續(xù)培養(yǎng)8 h 后，檢測(cè)A 值(方法同“2.3”項(xiàng))，計(jì)算細(xì)胞存活率［13-14］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.5 “含藥血清”對(duì)乙醇損傷L-02 細(xì)胞生化指標(biāo)的影響接種于48 孔板，體積為180 μL/孔，加樣和造模體積為20 μL/孔，其余方法同“2.4”項(xiàng)。繼續(xù)培養(yǎng)8 h 后，取培養(yǎng)液檢測(cè)ALT (波長(zhǎng)510 nm)、AST (波長(zhǎng)510 nm)活性，收集肝細(xì)胞檢測(cè)MDA (波長(zhǎng)530 nm)水平、SOD (波長(zhǎng)450 nm)活性［13-14］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

3 結(jié)果

3.1 確定建立肝細(xì)胞損傷模型的最佳乙醇濃度 表1 結(jié)果顯示，乙醇終濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L時(shí)，肝細(xì)胞的存活率分別為79.82%、65.84%、51.64%、28.95%。因此，實(shí)驗(yàn)濃度選擇100 mmol/L。

表1 不同濃度乙醇對(duì)L-02 肝細(xì)胞存活率的影響(±s，n=6)

表1 不同濃度乙醇對(duì)L-02 肝細(xì)胞存活率的影響(±s，n=6)

注:與正常組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

分組 乙醇終濃度/(mmol·L -1)A 值 存活率/%正常組 — 0.437 ±0.064—乙醇1 組 2.5 0.348 ±0.027△ 79.82 ±5.83乙醇2 組 5.0 0.289 ±0.029△△ 65.84 ±6.75乙醇3 組 10.0 0.222 ±0.046△△ 51.64 ±9.09乙醇4 組 20.0 0.127 ±0.025△△28.95 ±6.22

3.2 “含藥血清”對(duì)乙醇損傷L-02 肝細(xì)胞存活率的影響

表2 結(jié)果顯示，與正常組比較，陰性組吸光度值明顯減小，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)，細(xì)胞存活率為47.96%，表明造模成功。與陰性組比較， “含藥血清”終體積分?jǐn)?shù)為10.0%時(shí)，吸光度值明顯增大，細(xì)胞存活率為62.85%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)。

表2 “含藥血清”對(duì)乙醇損傷L-02 肝細(xì)胞存活率的影響(±s，n=6)

表2 “含藥血清”對(duì)乙醇損傷L-02 肝細(xì)胞存活率的影響(±s，n=6)

注:與正常組比較，△△P ＜0.01;與陰性組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分組 血清/% A 值 存活率/%正常組 — 0.494 ±0.065—陰性組 — 0.237 ±0.054△△ 47.96 ±10.97血清1 組 2.5 0.245 ±0.053△△ 49.50 ±10.82血清2 組 5.0 0.287 ±0.060△△ 57.72 ±12.15血清3 組 10.0 0.314 ±0.068△△＊ 62.85 ±13.84*

3.3 “含藥血清”對(duì)乙醇損傷L-02 肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST 活性的影響 表3 結(jié)果顯示，與正常組比較，陰性組ALT、AST 活性均明顯增大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)，表明造模成功。與陰性組比較， “含藥血清”終體積分?jǐn)?shù)為5.0%時(shí)，ALT、AST 活性均明顯減小，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05);“含藥血清”終體積分?jǐn)?shù)為10.0%時(shí)，ALT、AST 活性均明顯減小，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)。

表3 “含藥血清”對(duì)乙醇損傷L-02 肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST 活性的影響(±s，n=6)

表3 “含藥血清”對(duì)乙醇損傷L-02 肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST 活性的影響(±s，n=6)

注:與正常組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與陰性組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分組 血清/% ALT/(IU·L -1) AST/(IU·L -1)5.10 ±1.17 7.24 ±1.22陰性組 — 15.96 ±1.67△△ 17.46 ±2.36△△血清1 組 2.5 14.30 ±1.52△△ 15.48 ±1.95△△血清2 組 5.0 11.58 ±1.81△△＊ 13.20 ±2.16△△＊血清3 組 10.0 8.94 ±1.68△△＊ 10.27 ±1.95正常組 —△＊＊

3.4 “含藥血清”對(duì)乙醇損傷L-02 肝細(xì)胞中MDA 水平、SOD 活性的影響 表4 結(jié)果顯示，與正常組比較，陰性組MDA 水平明顯升高、SOD 活性明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)，表明造模成功。與陰性組比較，“含藥血清”終體積分?jǐn)?shù)為5.0%時(shí)，MDA 水平明顯降低、SOD 活性明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05);“含藥血清”終體積分?jǐn)?shù)為10.0%時(shí)，MDA 水平明顯降低、SOD 活性明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)。

表4 “含藥血清”對(duì)乙醇損傷L-02 肝細(xì)胞內(nèi)MDA 水平、SOD 活性的影響(±s，n=6)

表4 “含藥血清”對(duì)乙醇損傷L-02 肝細(xì)胞內(nèi)MDA 水平、SOD 活性的影響(±s，n=6)

注:與正常組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與陰性組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分組 血清/% MDA/(nmol·mgprot -1) SOD/(U·mgprot -1)正常組 —29.75 ±4.20 91.16 ±10.11陰性組 — 47.87 ±7.00△△ 32.60 ±7.45△△血清1 組 2.5 45.20 ±5.69△△ 35.39 ±8.56△△血清2 組 5.0 40.29 ±4.48△△＊ 45.55 ±10.78△△＊血清3 組 10.0 36.10 ±4.27△＊＊ 52.29 ±11.38△△＊＊

4 討論

乙醇經(jīng)過肝臟多種途徑代謝，氧化為乙醛和多種自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞過氧化、變性壞死、纖維化甚至肝硬化。自由基攻擊細(xì)胞膜后發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用，產(chǎn)生過氧化物，如MDA 等，其含有量的多少反映了機(jī)體過氧化損傷的程度。SOD 是最主要的抗氧化酶，其活性的高低反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱，在乙醇代謝過程中肝細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶消耗增加，SOD 活性升高反映了機(jī)體抗氧化能力的增強(qiáng)。ALT 和AST 主要位于肝細(xì)胞內(nèi)，是肝損傷最敏感的指標(biāo)。當(dāng)肝細(xì)胞膜通透性增加、肝細(xì)胞受損時(shí)，ALT、AST 會(huì)被釋放入血，血清中ALT、AST 活性升高。所以，通過檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)MDA 水平、SOD 活性以及血清中ALT、AST 活性，可以判斷肝臟氧化損傷的程度和藥物治療肝臟損傷的效果。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)ALT、AST 及SOD 活性和MDA 水平的變化，來(lái)觀察紫茉莉含藥血清對(duì)乙醇誘導(dǎo)L-02 肝細(xì)胞損傷的影響。檢測(cè)結(jié)果顯示: “含藥血清”終體積分?jǐn)?shù)為5.0%和10.0%，可以降低被損害肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST 活性，減少肝細(xì)胞內(nèi)MDA 水平，升高SOD 活性，增大肝細(xì)胞存活率。結(jié)果表明紫茉莉含藥血清可以降低乙醇對(duì)L-02 肝細(xì)胞的損害，增大肝細(xì)胞存活率，提示紫茉莉?qū)凭愿螕p害具有一定的防治作用。

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