周 霞， 楊詩龍， 胥 敏， 萬 軍，3*

(1. 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都610031;2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都611137;3. 國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)重點(diǎn)研究室，四川 成都610036)

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch、三角葉黃連Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao 或云連Coptis teeta wall 的干燥根莖，為四川道地藥材，其飲片包括生黃連、酒黃連、姜黃連和萸黃連4 種。目前，《中國藥典》僅通過薄層色譜法來區(qū)分萸黃連，而對(duì)其他黃連炮制品則尚無相關(guān)鑒別項(xiàng)［1］，雖然該方法簡便實(shí)用，但難以體現(xiàn)出各炮制品的差異性［2-3］。

電子舌又稱仿生味覺，是模擬人類味覺感受機(jī)理而設(shè)計(jì)的人工味覺系統(tǒng)，主要由非特異性、交互敏感的傳感器陣列組成，并通過合適的多元統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行信號(hào)模式識(shí)別，從而檢測(cè)液體樣品味覺特征的新型儀器［4-5］，其目的不在于檢測(cè)某個(gè)特定類型的化合物，而是對(duì)樣品中所有化合物的綜合響應(yīng)特征進(jìn)行檢測(cè)［6］。因此，組成成分相似的樣品有著相近的傳感器響應(yīng)特征，而成分差異較大的樣品的傳感器響應(yīng)特征也表現(xiàn)出明顯差異［7］，故根據(jù)味覺傳感器響應(yīng)特征即可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣品的鑒別區(qū)分。近年來，電子舌技術(shù)已經(jīng)在多個(gè)行業(yè)(如食品、農(nóng)產(chǎn)品、醫(yī)藥等)中得到廣泛應(yīng)用［8-15］。

本實(shí)驗(yàn)以黃連及其炮制品為研究對(duì)象，采用電子舌技術(shù)量化它們的味道數(shù)據(jù)。然后，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法處理降維數(shù)據(jù)，以期鑒別黃連及其不同炮制品。

1 材料與儀器

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)共收集生黃連樣品10 批，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本中心盧先明教授鑒定，均為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch 的干燥根莖。然后，根據(jù)《中國藥典》2010 年版一部(附錄ⅡD)炮制通則要求進(jìn)行炮制，結(jié)果共得到樣品40 批，詳細(xì)信息見表1。接著，從4 種炮制品中隨機(jī)抽取出12 個(gè)樣品作為未知樣品測(cè)試集，每種炮制品抽取3 個(gè)，盲法實(shí)驗(yàn)。

表1 黃連及其炮制品樣品信息Tab.1 Samples information of raw Coptis chinensis Franch and its processed products

1.2 儀器 ASTREE 電子舌，包括含7 根脂質(zhì)膜的傳感器陣列、自動(dòng)進(jìn)樣器、專用燒杯、信號(hào)接收處理系統(tǒng)、V2012.45 數(shù)據(jù)處理軟件(法國Alpha MOS公司);超純水制造系統(tǒng)(四川優(yōu)普超純科技有限公司);BP211D 電子天平(德國賽多利斯公司)。

2 分析方法

2.1 樣品制備 取生黃連適量，粉碎后過3 號(hào)篩，精密稱取1.0 g，置于250 mL 錐形瓶中，加水80 mL，浸泡30 min 后加熱回流1 h，放冷后過濾，取濾液20 mL，加水定容至100 mL，即得。另取酒黃連、姜黃連、萸黃連適量，采用相同方法處理。

2.2 分析方法 分析參數(shù)為采集溫度25 ℃;數(shù)據(jù)采集時(shí)間120 s;采集周期1 s;攪動(dòng)速度1 r/s。以超純水為清洗液，每次測(cè)量前先清洗傳感器10 s。

樣品測(cè)定方法為將配制好的樣品溶液置于100 mL 電子舌專用燒杯中，以100 ～120 s 內(nèi)的平均值作為傳感器信號(hào)輸出值，每份樣品按上述信號(hào)采集參數(shù)平行測(cè)定10 次。然后，取其最后4 次的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2.3 重復(fù)性考察 電子舌包括7 個(gè)脂質(zhì)膜傳感器，分別為ZZ、AB、GA、BB、CA、DA、JE，即每個(gè)樣品有7 組數(shù)據(jù)，其采集情況見圖1。然后，以采集時(shí)間為橫坐標(biāo)，響應(yīng)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，采集120 s。

圖1 生黃連電子舌傳感器響應(yīng)強(qiáng)度曲線Fig.1 Electronic tongue sensor response intensity curve of raw Coptis chinensis Franch

接著，按“2.1”及“2.2”項(xiàng)下方法操作，以黃連樣品S1、A1、J1 及Y1 為例，進(jìn)行重復(fù)性考察，結(jié)果見表2。由表可知，各傳感器輸出值的RSD 均小于2%，說明數(shù)據(jù)可靠，儀器穩(wěn)定性良好。

表2 電子舌重復(fù)性考察結(jié)果(n=4)Tab.2 Inspection result of the reproducibility of electronic tongue (n=4)

3 結(jié)果

3.1 傳感器響應(yīng)值分析 以同一批生黃連(S1)及其炮制品(酒黃連A1、姜黃連J1、萸黃連Y1)為例，根據(jù)其電子舌傳感器輸出值建立雷達(dá)圖，見圖2。由圖可知，生黃連、酒黃連、姜黃連及萸黃連在電子舌傳感器的響應(yīng)特征上均存在明顯差異。

圖2 黃連及其炮制品電子舌傳感器雷達(dá)圖Fig.2 Radar chart of electronic tongue sensor of Coptis chinensis Franch and its processed products

3.2 軟獨(dú)立建模分析 將電子舌傳感器獲取的各樣品響應(yīng)值進(jìn)行軟獨(dú)立建模分析(SIMCA)，結(jié)果見圖3。由圖可知，藍(lán)色區(qū)域是以生黃連為參照的模型區(qū)域，而酒黃連、姜黃連及萸黃連的圖標(biāo)均在參照區(qū)域外，即生黃連與其炮制品的區(qū)分效果較好，表明SIMCA 分析可用于生黃連及其炮制品的鑒別。

圖3 黃連及其炮制品SIMCA 分析二維圖Fig.3 SIMCA of Coptis chinensis Franch and its processed products

3.3 主成分分析 將電子舌傳感器獲取的各樣品響應(yīng)值進(jìn)行主成分分析(PCA)，結(jié)果見圖4。由圖可知，PC1、PC2 與PC3 三者的總貢獻(xiàn)率達(dá)96.7%，能較好地反映原始數(shù)據(jù)特征，而且生黃連、酒黃連、姜黃連及萸黃連在PCA 分析三維圖上能明顯區(qū)分開，表明生黃連及其炮制品在PCA模型上的區(qū)分度較理想。

圖4 黃連及其炮制品PCA 分析三維圖Fig.4 PCA of Coptis chinensis Franch and its processed products

3.4 判別因子分析 將電子舌傳感器獲取的各樣品響應(yīng)值進(jìn)行判別因子分析(DFA)，將40 批樣品所得的160 組數(shù)據(jù)建立模型，測(cè)試集為隨機(jī)抽樣樣品的12 組數(shù)據(jù)(即每類樣品中隨機(jī)抽出3 個(gè)作為未知樣品)，見圖5。由圖可知，DF1、DF2 與DF3三者的總貢獻(xiàn)率達(dá)100%，即生黃連及其炮制品在DFA 三維圖上的區(qū)分度良好。同時(shí)，還判別了4個(gè)組的12 個(gè)未知樣品，發(fā)現(xiàn)其均落在相應(yīng)的組別之中或附近，判別識(shí)別率達(dá)100%。

圖5 黃連及其炮制品DFA 分析三維圖Fig.5 DFA of Coptis chinensis Franch and its processed products

3.5 線性判別分析 將電子舌傳感器獲取的各樣品響應(yīng)值進(jìn)行線性判別分析(LDA)，發(fā)現(xiàn)前兩個(gè)函數(shù)的累積方差貢獻(xiàn)率為98.6%，其中前者為91.1%，而后者為7.5%，見圖6。由圖可知，LDA 分析能很好地區(qū)分各樣品，其分類函數(shù)如下。同時(shí)，LDA 分析結(jié)果顯示，其對(duì)樣品和交叉驗(yàn)證分組案例的判別識(shí)別率均為100%。

Y1= -1.244X1+6.508X2-3.061X3+1.371X4+11.310X5+0.556X6+2.750X7-15 604.597

Y2= -1.819X1+7.954X2-5.070X3+3.245X4+13.240X5+0.883X6+1.816X7-20 014.637

Y3= -1.792X1+8.826X2-4.869X3+2.550X4+13.323X5+0.847X6+2.298X7-21 045.087

Y4= -1.597X1+7.140X2-4.188X3+2.189X4+12.561X5+0.768X6+2.535X7-18 141.712

注:Y1、Y2、Y3、Y4分別為生黃連、萸黃連、姜黃連、酒黃連;X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7分別為傳感器ZZ、AB、GA、BB、CA、DA、JE 的響應(yīng)值。

圖6 黃連及其炮制品LDA 分析二維圖Fig.6 LDA of Coptis chinensis Franch and its processed products

3.6 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 將電子舌獲取的黃連及其炮制品的傳感器響應(yīng)值(共160 組數(shù)據(jù))構(gòu)建BPANN 模型，另將抽樣獲取的12 組數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證測(cè)試集。網(wǎng)絡(luò)為三層BP 神經(jīng)，其輸入層單元、輸出層單元和隱藏層的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)分別為7、4 和10個(gè)，網(wǎng)絡(luò)隱藏層和輸出層的傳遞函數(shù)均為TANSIG，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練算法采用TRAINLM，網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)函數(shù)采用LEARNGDM，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練誤差設(shè)置為1.0 ×10-5，最大訓(xùn)練次數(shù)為1 000。在進(jìn)行6 次訓(xùn)練后，模型訓(xùn)練誤差減少為2.3 ×10-6，表明效果良好。然后，對(duì)測(cè)試集樣品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果其綜合判別率為91.7%，見表3。

表3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)黃連及其炮制品識(shí)別結(jié)果Tab.3 BP-ANN recognition result of Coptis chinensis Franch and its processed products

表3 顯示，訓(xùn)練集和測(cè)試集樣品的綜合識(shí)別率都達(dá)90%以上，對(duì)生黃連、酒黃連、姜黃連、萸黃連的綜合識(shí)別率分別為100%、97.8%、100%、100%，對(duì)所有172 個(gè)樣品數(shù)據(jù)的綜合判別率為99.4%，表明判別效果良好。

4 討論

4.1 黃連“味”特征的差異特點(diǎn) “辨狀論質(zhì)”是根據(jù)中藥材的性狀等特征來判斷其真?zhèn)蝺?yōu)劣，為經(jīng)典、實(shí)用、簡便的傳統(tǒng)鑒別方法［16］，但目前研究方法側(cè)重于區(qū)分各藥材的質(zhì)量上，而對(duì)其炮制品有效的鑒別手段較少。前期本課題組發(fā)現(xiàn)，黃連炮制前后“氣味”發(fā)生的變化難以用現(xiàn)有化學(xué)方法區(qū)分，故采用電子鼻技術(shù)來進(jìn)行鑒別探索［17］。另外，黃連的苦味也是鑒別其質(zhì)量優(yōu)劣的重要特征之一，在炮制品中，由于姜黃連“有姜的辛辣味”［1］，因此可利用黃連及其炮制品的味覺特征差異來進(jìn)行鑒別。

4.2 各化學(xué)計(jì)量法在黃連“味”鑒別中的應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)采用電子舌技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)黃連及其炮制品的味覺特征進(jìn)行分析研究。其中，SIMCA 主要用于區(qū)分生品(不加輔料)與炮制品(加輔料);PCA、LDA、DFA 及BP-ANN 可區(qū)分不同炮制品(包括生品)，而且DFA 和BP-ANN 在判斷未知樣品方面具有更好的區(qū)分度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIMCA 模型區(qū)分了黃連炮制品與生品;PCA、LDA、DFA 及BP-ANN 模型區(qū)分了黃連的不同炮制品;DFA 模型對(duì)未知樣品的正確判別率為100%，而BP-ANN 模型為91.7%。綜上所述，SIMCA、PCA、DFA、LDA 及BP-ANN 模型均可用于電子舌味覺特征分析，從而對(duì)黃連及其炮制品進(jìn)行鑒別區(qū)分，并且電子舌技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法的結(jié)合能為中藥飲片的鑒別研究提供思路與參考。

［1］ 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:285.

［2］ 張漢明，許鐵峰，秦路平，等. 中藥鑒別研究的發(fā)展和現(xiàn)代鑒別技術(shù)介紹［J］. 中成藥，2000，22(1):101-109.

［3］ 李鐵鋼，李鈺婷，武小赟，等. 黃連及其炮制品薄層鑒別方法的研究［J］. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22(3):677-679.

［4］ 鄧少平，田師一. 電子舌技術(shù)背景與研究進(jìn)展［J］. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26(4):110-116.

［5］ 李文敏，吳純潔，艾 莉，等. 基于電子鼻、電子舌技術(shù)實(shí)現(xiàn)中藥性狀氣味客觀化表達(dá)的展望［J］. 中成藥，2009，31(2):282-284.

［6］ Han F，Huang X，Teye E，et al. Nondestructive detection of fish freshness during its preservation by combining electronic nose and electronic tongue techniques in conjunction with chemometric analysis［J］. Anal Methods，2014，6(2):529-536.

［7］ Ampuero S，Bosset J O. The electronic nose applied to dairy products:a review［J］. Sensor Actuat B-Chem，2003，94(1):1-12.

［8］ Peris M，Escuder-Gilabert L. On-line monitoring of food fermentation processes using electronic noses and electronic tongues:A review［J］. Anal Chim Acta，2013，804:29-36.

［9］ Escuder-Gilabert L，Peris M. Review:highlights in recent applications of electronic tongues in food analysis［J］. Anal Chim Acta，2010，665(1):15-25.

［10］ Woertz K，Tissen C，Kleinebudde P，et al. Taste sensing systems (electronic tongues)for pharmaceutical applications［J］.Int J Pharm，2011，417(1-2):256-271.

［11］ Li Y J，Lei J C，Yang J N，et al. Classification of tieguanyin tea with an electronic tongue and pattern recognition［J］. Anal Lett，2014，47(14):2361-2369.

［12］ Eckert C，Lutz C，Breitkreutz J，et al. Quality control of oral herbal products by an electronic tongue-Case study on sage lozenges［J］. Sensor Actuat B-Chem，2011，156(1):204-212.

［13］ Kataoka M，Tokuyama E，Miyanaga Y，et al. The taste sensory evaluation of medicinal plants and Chinese medicines［J］. Int J Pharm，2008，351(1-2):36-44.

［14］ 杜瑞超，王優(yōu)杰，吳 飛，等. 電子舌對(duì)中藥滋味的區(qū)分辨識(shí)［J］. 中國中藥雜志，2013，38(2):154-160.

［15］ 吳 飛，杜瑞超，洪燕龍，等. 電子舌在鑒別中藥枳實(shí)藥材產(chǎn)地來源中的應(yīng)用［J］. 中國藥學(xué)雜志，2012，47(10):808-812.

［16］ 謝宗萬. 中藥品種傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別“辯狀論質(zhì)”論［J］. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，1993，5(36):19-21.

［17］ 胥 敏，楊詩龍，張 超，等. 基于氣味客觀化的黃連及其炮制品鑒別研究［J］. 中國中藥雜志，2015，40(1):17-21.