劉 宇， 張明明， 劉墨祥

(揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 天然藥物研究室，江蘇 揚州225000)

速效止瀉膠囊是依據(jù)《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》第13 冊制訂的處方和制法而生產(chǎn)的中成藥，該制劑由鹽酸小檗堿和拳參組成，其主要功能為清熱利濕，收斂止瀉，用于赤痢、熱瀉、腸炎等［1］。拳參具有清熱解毒、消腫、止血之功效，主治赤痢熱瀉、肺熱咳嗽、癰腫瘰疬、口舌生瘡、血熱吐衄、痔瘡出血、蛇蟲咬傷［2］?，F(xiàn)代抗菌實驗表明拳參對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草桿菌、大腸桿菌等均有抗菌作用［3-4］，其有效成分主要為沒食子酸和綠原酸。有文獻報道了測定速效止瀉膠囊中鹽酸小檗堿［5-7］和沒食子酸及綠原酸的含有量［8-10］，但拳參原藥材對膠囊質(zhì)量的檢測影響均沒有提及。鑒于速效止瀉膠囊中鹽酸小檗堿［11-12］是以化合物定量加入質(zhì)量可控，而其中的沒食子酸、綠原酸、兒茶酚及可水解生成沒食子酸的鞣質(zhì)等有效成分的含有量則隨拳參原料藥材的質(zhì)量而異，需有效技術(shù)監(jiān)控。所以，本研究擬針對速效止瀉膠囊中拳參的主要有效成分沒食子酸和綠原酸兩個指標建立簡便、靈敏、準確的RP-HPLC 定量檢測方法與技術(shù)，并針對速效止瀉膠囊中拳參所共有的多個指標成分建立專屬性強、方法簡便的高效液相色譜指紋圖譜定性鑒別方法與技術(shù);同時對野生拳參特征峰進行識別。

1 儀器與試藥

Waters 高效液相色譜儀，包括Waters 1525 Binary HPLC Pump 色譜泵，Waters 2487 雙通道紫外檢測器，色譜柱恒溫箱;Waters SymmetrySheildTMRP18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，包括Empower 色譜工作站;Sartorius CAP225 電子天平(德國賽多利斯公司)。沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度為0.899，批號110831-201204);綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度為0.966，批號110753-201314)。速效止瀉膠囊 (甘肅岷海制藥有限責任公司，批號130701)。野生拳參飲片(蘇北人民醫(yī)院)，經(jīng)揚州大學(xué)劉墨祥教授鑒定。乙腈和甲醇為色譜純;甲酸為分析純;水為超純水。

2 溶液制備

2.1 對照品溶液制備 分別精密稱定適量沒食子酸和綠原酸對照品，加50%甲醇制成對照品混合溶液，其中沒食子酸質(zhì)量濃度為183.39 μg/mL，綠原酸質(zhì)量濃度為208.65 μg/mL。

2.2 供試品溶液制備 從同一批次膠囊中取出10粒，將膠囊粉末混合并研細，取0.1 g，精密稱定后，置于10 mL 具塞試管中，精密加入6 mL 50%甲醇，密封并稱定質(zhì)量，浸泡2 h，30 ℃下超聲20 min，冷卻至室溫后再稱定質(zhì)量，加50%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm 濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性樣品溶液制備 按處方制備不含拳參的陰性樣品，取適量，按“2.2”項方法制成陰性樣品溶液。

3 色譜條件

采用Waters SymmetrySheildTMRP18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mmm);流動相為0.1%甲酸溶液(A)-乙腈 (B)，梯度洗脫 (0 ～10 min，92.5%A;10 ～11 min，92.5% ～90% A;11 ～40 min，90%A);體積流量0.8 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長290 nm;通過20 μL 定量環(huán)保持進樣量恒定。

4 方法與結(jié)果

4.1 專屬性試驗 分別吸取供試品溶液、對照品混合溶液和陰性樣品溶液注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測定，進樣量均為20 μL，記錄色譜圖。沒食子酸和綠原酸的保留時間分別為8.824 min 及34.573 min，待測組分峰形良好且與相鄰組分達到基線分離，不受其他組分干擾，分離度均大于2，理論塔板數(shù)以沒食子酸和綠原酸計算均大于8 000 (見圖1)。

4.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1”項下的對照品混合溶液2 mL，精密吸取1 mL 置于指形管中作為待測樣品1，剩余的1 mL 對照品混合溶液中精密加入50%甲醇1 mL，得到2 mL 稀釋了1 倍的對照品混合溶液。按上述方法重復(fù)操作4 遍，得到倍比稀釋的6 個質(zhì)量濃度樣品溶液，在上述色譜條件下，分別注入液相色譜儀，進樣量均為20 μL。以對照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(C)，測定的峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得沒食子酸和綠原酸線性回歸方程為Y=5.618 7 ×104C-0.164 53 × 104(r = 1);Y = 5.577 9 × 104C -12.202 8 ×104(r =0.999 9)。結(jié)果表明沒食子酸在5.73 ～183.39 μg/mL、綠原酸在6.52 ～208.65 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 混合對照品、樣品和陰性樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances，samples and negative sample

4.3 精密度試驗 吸取對照品混合溶液，按照上述色譜條件測定，進樣量為20 μL，連續(xù)進樣5次，記錄峰面積。結(jié)果沒食子酸峰面積的RSD 為1.4%，綠原酸峰面積的RSD 為0.6%，表明所用儀器的精密度良好。

4.4 重復(fù)性試驗 取同一批(批號130701)膠囊粉末5 份，每份0.1 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制成供試品溶液，依法測定。沒食子酸平均含有量為1.45 mg/g (RSD =1.2%)，綠原酸平均含有量為5.34 mg/g (RSD =1.1%)，表明方法重復(fù)性良好。

4.5 穩(wěn)定性試驗 吸取同一供試品溶液(批號130701)，按上述色譜條件間隔不同時間測定5 次，沒食子酸和綠原酸RSD 分別為1.1%和0.7%，表明供試品溶液在室溫條件下放置12 h 后沒食子酸和綠原酸的質(zhì)量濃度無明顯改變，方法穩(wěn)定可行。

4.6 加樣回收試驗 參照“4.4”項下所測樣品中沒食子酸和綠原酸的含有量，精密稱取沒食子酸和綠原酸對照品適量，分別加入50%甲醇制得供加樣回收用對照品溶液，其中沒食子酸和綠原酸質(zhì)量濃度分別為141.07 μg/mL 和521.64 μg/mL。稱取“2.2”項下研細的膠囊粉末樣品 (批號130701)約0.1 g，共5 份，精密稱定，在樣品中分別精密加入上述對照品溶液沒食子酸1 mL、綠原酸1 mL、50%甲醇4 mL，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“3”項色譜條件進行測定，計算回收率(見表1)。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=5)Tab.1 Result of recovery tests (n=5)

5 樣品測定

按上述色譜條件，對不同批次的速效止瀉膠囊樣品進行測定，記錄峰面積，代入標準曲線方程計算沒食子酸和綠原酸量(見表2)。

表2 樣品測定結(jié)果(n=5)Tab.2 Result of determination of samples (n=5)

6 討論

6.1 沒食子酸峰和綠原酸峰的確認 文獻［13-14］報道拳參中含有沒食子酸和綠原酸，而在本實驗色譜條件下，速效止瀉膠囊提取樣品的兩個色譜峰與沒食子酸和綠原酸對照品的色譜峰保留時間一致，且紫外光譜圖吻合，于是將樣品進行HPLCMS 鑒定，在正負離子檢測條件下，8.5 min 時分別出現(xiàn)m/z 171、169 分子離子峰，34.5 min 時分別出現(xiàn)m/z 355、353 (見圖2)分子離子峰，本實驗對速效止瀉膠囊提取樣品中保留時間為8.5 min和34.5 min 的色譜峰從保留時間、紫外光譜圖、相對分子質(zhì)量三方面驗證其分別為沒食子酸和綠原酸。

圖2 沒食子酸與綠原酸質(zhì)譜圖Fig.2 Spectra of gallic acid and chlorogenic acid

6.2 提取方法、溶劑、時間的考察 樣品中沒食子酸和綠原酸來自拳參粉末，參考文獻［13-14］，提取方法和時間考察了冷浸法，分別考察了冷浸2 h后30 ℃超聲20、40 min 及冷浸放置過夜后30 ℃超聲20、40 min。結(jié)果表明冷浸2 h 后超聲提取待測組分沒食子酸和綠原酸提取效果比較好，而且節(jié)省時間，所以提取方法確定為冷浸2 h 后30 ℃超聲20 min。所測組分為酚酸類，易溶于水和強極性溶劑中，考察了水、20% 乙醇、50% 乙醇、30%甲醇、50%甲醇的提取情況。結(jié)果顯示50%甲醇提取效果比較好，確定提取溶劑為50%甲醇。

6.3 流動相的選擇 對甲醇-超純水(25 ∶75)、甲醇-0.4%冰醋酸(25 ∶75)、甲醇-0.1 磷酸(10∶90)、乙腈-0.4%冰醋酸(10 ∶90)、乙腈-0.1%磷酸(10 ∶90)、乙腈-0.1%甲酸(梯度)不同流動相進行考察，發(fā)現(xiàn)乙腈作為有機相時系統(tǒng)柱壓比較小，流動相中加入一定量甲酸和磷酸均可改善峰形和分離度，為了增加色譜柱的穩(wěn)定性和使用壽命，以及后期液質(zhì)聯(lián)機對指紋峰識別時不適合用磷酸，所以選用乙腈-0.1 甲酸(梯度)。

6.5 檢測波長的選擇 沒食子酸在220 nm 及270 nm 處有最大吸收，綠原酸在218 nm 及327 nm 處有最大吸收，為使二者均有較好且相當?shù)撵`敏度，選擇290 nm 為檢測波長［15］。

［1］ 《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》第13 冊:速效止瀉膠囊［S］.

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