葛 飛， 石貝杰， 龔 倩， 昂安娜， 桂 琳

(1. 安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000;2. 皖南醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室，安徽蕪湖241000)

蜂膠是蜜蜂從植物的幼芽與樹干裂縫處采集的樹膠與其上顎腺分泌物和蜂蠟等混合加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物［1］。蜂膠具有顯著的抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等生物學(xué)活性，這與蜂膠富含黃酮類、酚酸及其酯類化學(xué)成分有密切關(guān)系［2-5］。因此，蜂膠的化學(xué)成分、生物學(xué)活性、藥理作用一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

微波萃取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品、中草藥、化妝品等領(lǐng)域。目前，已有較多文獻(xiàn)報(bào)道微波技術(shù)用于天然產(chǎn)物中黃酮類、酚酸類成分的提取［6-9］。本研究在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法，考察微波功率、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量等不同因素對(duì)安徽蜂膠中總酚酸提取率的影響，以確定安徽蜂膠總酚酸的最佳提取工藝方案，為安徽蜂膠資源更好地開發(fā)利用提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 蜂膠原料由蕪湖賀記食品有限公司從安徽蕪湖、宣城、績(jī)溪等不同蜂場(chǎng)收取，惠贈(zèng)。沒食子酸、Folin-Ciocalteu 試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 UV-2100 型紫外-可見分光光度計(jì) (UNICO(上海)儀器有限公司);WK-600A 高速粉碎機(jī)(青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司);G80L20CSL-DG 微波爐(格蘭仕電器有限公司);L550 型臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);AL204 型分析天平(梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠預(yù)處理 將蜂膠置于冰箱冷凍室，待其冷凍后，用鈍器迅速將其砸碎，快速轉(zhuǎn)移到粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后過60 目篩，置于封口袋中冷凍保存，備用。

1.3.2 蜂膠總酚酸的微波提取 準(zhǔn)確稱取已粉碎的蜂膠1.000 g，置于200 mL 的具塞錐形瓶中，按一定的微波功率、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和乙醇用量的不同試驗(yàn)條件下分別進(jìn)行微波提取，提取液經(jīng)離心機(jī)離心后取上清液，冷卻，定容后作為待測(cè)液備用。

1.3.3 蜂膠總酚酸的定量測(cè)定 采用Fo1in-Ciocalteu 法進(jìn)行蜂膠中總酚酸的定量測(cè)定［10］，在765 nm 處測(cè)定吸光值，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖。本試驗(yàn)所得的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y =0.081 4x -0.006 7，r2=0.999 6。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算蜂膠中總酚酸含有量(相對(duì)于蜂膠量的提取量，以沒食子酸計(jì)mg/g，DW)。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 在試驗(yàn)條件微波功率480 W、萃取時(shí)間30 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、乙醇用量25 mL 下，分別研究微波功率、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和乙醇用量4 個(gè)因素對(duì)蜂膠中總酚酸提取效果的影響。

1.3.5 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用BBD-RSM 法設(shè)計(jì)優(yōu)化蜂膠中總酚酸的微波提取工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波功率對(duì)蜂膠中總酚酸提取率的影響 在微波功率160 ～480 W 范圍內(nèi)時(shí)，總酚酸提取率隨微波功率的增大而增加，在480 W 時(shí)達(dá)到較高值，隨后逐漸減小。因此，選擇480 W 作為較佳微波功率。

表1 試驗(yàn)因素水平

2.1.2 萃取時(shí)間對(duì)蜂膠中總酚酸提取率的影響 在微波處理時(shí)間在20 ～40 s 范圍內(nèi)時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚酸的提取率逐漸增加，在處理時(shí)間為40 s 時(shí)達(dá)到較大值，之后逐漸下降。因此，選擇40 s 為較佳萃取時(shí)間。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜂膠中總酚酸提取率的影響 在45% ～75%乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)時(shí)，總酚酸提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大逐漸增加;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，總酚酸提取率達(dá)到較大值。在75% ～95%乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，總酚酸提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而減小。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%作為較佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.1.4 乙醇用量即料液比(g/mL)對(duì)蜂膠中總酚酸提取率的影響 乙醇用量為25 mL 時(shí)，總酚酸提取率較大，之后提取率逐漸下降，故選擇乙醇用量為25 mL 即料液比為1 ∶25 (g/mL)作為較佳乙醇用量。

2.2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以Y 總酚酸含有量(%)為響應(yīng)值，用Design-Expert8.0.6.1 軟件對(duì)表2 中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，可建立如下二次回歸方程: Y =27.18 +1.17A +0.76B +0.61C +1.46D+0.71AB -0.69AC -0.09AD +0.31BC +0.06BD -0.40CD -2.81A2-2.44B2-2.47C2-1.76D2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析見表3。

由表3 可知，該模型p ＜0.000 1，說明該模型得到的回歸方程差異極顯著。在模型各參數(shù)中，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2的置信度均在95%水平以上，說明這些因素在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中均為顯著項(xiàng)，即微波功率、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和乙醇用量均對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較大影響。同時(shí)，模型相關(guān)系數(shù)R2= 96.07%、調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2=92.13%、預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)R2=78.44%，表明該模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值擬合合理，并能做出相對(duì)準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。變異系數(shù)CV=2.91%，說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，結(jié)果真實(shí)可信。

表3 Box-Behnken Design 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析

2.3 響應(yīng)面分析 運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到微波功率、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和乙醇用量四個(gè)因素兩兩之間響應(yīng)面立體分析圖如圖1 ～5 所示。曲面圖可以直觀地反映出各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，等高線可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著、橢圓形表示兩因素交互作用顯著。由圖1 ～5 可以看出，微波功率、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和乙醇用量4 個(gè)因素均能形成較好的交互作用關(guān)系。

為進(jìn)一步確定最佳工藝點(diǎn)，用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行數(shù)值優(yōu)化分析，以獲取最佳試驗(yàn)條件。經(jīng)軟件分析，最佳提取條件為微波功率514.91 W、萃取時(shí)間41.97 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)75.73%和乙醇用量29.02 mL。在此條件下，安徽蜂膠中總酚酸提取率為27.698 2%。考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性，將各提取工藝參數(shù)修正為微波功率480 W、萃取時(shí)間42 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)76% 和乙醇用量29 mL。依據(jù)響應(yīng)面分析所得修正后的最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得安徽蜂膠總酚酸平均提取率為27.62%，與模型預(yù)測(cè)值相差較小，證明該模型擬合較好。因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的安徽蜂膠中總酚酸的最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際運(yùn)用價(jià)值。

圖1 微波功率和萃取時(shí)間交互作用對(duì)蜂膠總酚酸提取率影響的響應(yīng)面圖

圖2 微波功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對(duì)蜂膠總酚酸提取率影響的響應(yīng)面圖

圖3 微波功率和乙醇用量交互作用對(duì)蜂膠總酚酸提取率影響的響應(yīng)面圖

圖4 萃取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對(duì)蜂膠總酚酸提取率影響的響應(yīng)面圖

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和乙醇用量交互作用對(duì)蜂膠總酚酸提取率影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

蜂膠是一種復(fù)雜的混合物，含有大量的生物活性成分，且隨產(chǎn)地和提取方法的不同而存在顯著差異［11］，因此，尋找到安徽蜂膠中酚酸類有效活性成分的較優(yōu)提取工藝具有重要的理論和實(shí)踐意義。微波輔助提取技術(shù)作為一種新型提取工藝，具有升溫快、控制方便等優(yōu)點(diǎn)，在天然活性成分提取方面，已被廣泛使用，特別適合熱敏性物質(zhì)的提?。?2-14］。

在實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微波功率、提取時(shí)間及乙醇用量確定后，蜂膠萃取體系所能達(dá)到的溫度基本恒定，因此未對(duì)溫度效應(yīng)進(jìn)行試驗(yàn)和探討。本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化法結(jié)合實(shí)驗(yàn)的可操作性，得出安徽蜂膠中總酚酸的最佳微波萃取條件為微波功率480 W、萃取時(shí)間42 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)76% 和乙醇用量29 mL，該工藝條件下提取率可達(dá)27.62%。該方法提取效率高，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，為安徽蜂膠中酚酸類物質(zhì)的提取提供了一定的參考依據(jù)和技術(shù)支持。

［1］ Erdogam S，Ates B，Durmaz G，et al. Pressurized liquid extraction of phenolic compounds from Anatolia propolis and their radical scavenging capacities［J］. Food Chem Toxicol，2011，49(7):1592-1597.

［2］ 郭夏麗，羅麗萍，徐元君，等. 不同季節(jié)中國(guó)蜂膠醇提物的化學(xué)成分及生物活性［J］. 食品科學(xué)，2011，32(17):141-146.

［3］ Gregory A G，Toshitaka U，F(xiàn)umihiko T，et al. Effect of vapors from fractionated samples of propolis on microbial and oxidation damage of rice during storage［J］. J Food Engineer，2008，88(3):341-352.

［4］ Koru O，Toksoy F，Acikel C H，et al. In vitro antimicrobial activity of propolis samples from different geographical origins against certain oral pathogens［J］. Anaerobe，2007，13(3/4):140-145.

［5］ Isla M I，Nieva Moreno M I，Sampietro A R，et al. Antioxidant activity of Argentine propolis extracts［J］. Ethnopharmacol，2001，76(2):165-170.

［6］ 陳 合，李世玉，王利紅，等. 微波輔助提取黃姜色素的研究［J］. 食品工業(yè)科技，2010，31(3):285-289.

［7］ 鄒建國(guó)，劉 飛，羅 平，等. 微波輔助提取馬錢子中總生物堿工藝［J］. 食品科學(xué)，2010，31(18):116-118.

［8］ 李加興，李敏利，劉 飛，等. 微波輔助提取獼猴桃根多糖工藝優(yōu)化［J］. 食品科學(xué)，2010，31(4):42-45.

［9］ 周 達(dá)，羅 成，魯曉翔. 玫瑰花總黃酮微波輔助提取及其抗氧化研究［J］. 食品工業(yè)科技，2010，31 (4):269-272.

［10］ Aline M，Lamine C E，Romito M，et al. Determination of the total phenolic，flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey，as well as their radical scavenging activity［J］. Food Chem，2005，91(3):571-577.

［11］ 朱恩圓，鄒彥平，魏東芝，等. 蜂膠有效成分的含量測(cè)定及質(zhì)量控制［J］. 中成藥，2005，27(7):835-836.

［12］ 李志洲. 提子皮中多酚類物質(zhì)的微波提取及抗氧化性研究［J］. 中成藥，2009，31(12):1939-1942.

［13］ Chunhui D，Ning L，Mingxia G，et al. Recent developments in sample preparation techniques for chromatography analysis of traditional Chinese medicines［J］. J Chromatogr A，2007，1153(12):90-96.

［14］ 張明霞，呼秀智，龐建光，等. 微波輔助玉米芯酸水解提取木糖條件優(yōu)化［J］. 食品科學(xué)，2012，33(2):39-42.