劉天嬌， 劉福強， 王艷萍， 張 琦， 劉 丹， 趙雪竹

(1. 延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉133000;2. 中國人民解放軍208 醫(yī)院，吉林 長春130062)

白及Bletilla striata L. 為蘭科白及屬植物，有止血、補肺、消腫、療瘡的功效，容易被組織吸收、毒性小等特點［1］。白及多糖為白及干燥塊莖經(jīng)水提醇沉后所得到的一種天然多糖，主要由β-1，4-甘露糖和β-1，4-葡萄糖組成［2］，含有豐富的活性羥基，可進行膽甾醇化［3］、脫氧膽?；?］等化學(xué)修飾;具有親水性，在水中易溶蝕，由于分子中缺少疏水區(qū)域，包載藥物能力低，應(yīng)用范圍有所限制。

膽甾醇亦稱膽固醇是存在于人體中的天然物質(zhì)，具有甾環(huán)結(jié)構(gòu)和疏水性特點，生物相容性好。通過膽甾醇對白及多糖進行化學(xué)修飾，使其具有兩親性特點，可以為后續(xù)自組裝成納米粒，其疏水內(nèi)核包載難溶性藥物，達到緩釋，實現(xiàn)靶向給藥做鋪墊，為拓展其應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 79-2 型雙向磁力攪拌器(江蘇榮華儀器制造有限公司);ZK-82B 型真空干燥器箱(上海實驗儀器總廠);THZ-82 水浴恒溫振蕩器(金壇市華城創(chuàng)威實驗儀器廠);XW-80A 渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);DN-12A 氮氣吹干儀(天津市東康科技有限公司);UV-3 系列紫外可見分光光度計 (上海美譜達儀器有限公司);6700FT-IR Spectrometer (PT. Contitus CO. LTD. Nicolet 公司);400 MHz 液態(tài)核磁共振波譜儀(德國Bruker 公司)。

1.2 試劑 白及多糖(實驗室自制);膽甾醇(北京鼎國生物技術(shù)公司);琥珀酸酐(國藥集團化學(xué)試劑公司);1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(上海源葉生物科技有限公司);4-二甲氨基吡啶(天津市凱瑪生化科技有限公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 合成步驟

2.1.1 膽甾醇琥珀酸酯的合成［5］取膽甾醇5 g 和琥珀酸酐5 g 溶解于100 mL 除水吡啶中，室溫反應(yīng)72 h 后終止反應(yīng)，反應(yīng)液滴入pH 1 ～2 的冰鹽酸溶液中，析出白色絮狀沉淀。冷藏過夜，抽濾，收集沉淀。沉淀用蒸餾水洗至pH ＞5，于乙酸乙酯/乙醇中重結(jié)晶，80 ℃下干燥，得白色針狀膽甾醇琥珀酸酯(CHS)純品。見圖1。

圖1 膽甾醇琥珀酸酯(CHS)的合成路線

2.1.2 膽甾醇琥珀酰基白及多糖的合成 取白及多糖樣品0.5 g 溶解于30 mL 無水二甲基亞砜中，備用;取一定量的膽甾醇琥珀酸酯(CHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC，EDC/CHS =1.2，mol/mol)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，DMAP/CHS =1，mol/mol)，溶解于20 mL 的二甲基亞砜中，室溫攪拌，反應(yīng)活化2 h;將活化反應(yīng)液滴入白及多糖溶液中，反應(yīng)48 h，停止反應(yīng)。將反應(yīng)液滴入500 mL 無水乙醇中，析出白色沉淀，抽濾。分別用適量的乙醇、四氫呋喃和乙醚洗滌產(chǎn)物，80 ℃下真空干燥，即為合成的膽甾醇琥珀?；准岸嗵?CHSB)。改變CHS 的用量，制備了不同取代度的CHSB，記為CHSB1、CHSB2、CHSB3。見圖2。

圖2 膽甾醇琥珀?；准岸嗵?CHSB)的合成路線，R=CHS

2.1.3 合成工藝條件考察 按照L9(33)正交設(shè)計，以催化劑用量、活化時間和反應(yīng)時間三因素進行三水平考察，以合成的膽甾醇琥珀?；准岸嗵钱a(chǎn)率為評價指標，優(yōu)選合成工藝。正交試驗因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平

通過直觀分析、極差值、方差分析可以看出，各因素的主要影響順序為A ＞C ＞B，因素A 和因素C 具有顯著性差異，因素B 沒有顯著性差異，確定最佳合成工藝A3B1C2，即催化劑用量(mEDC/mDMAP)1.420 g/0.754 g，活化時間2 h，反應(yīng)時間48 h。

表2 正交試驗安排及結(jié)果

表3 方差分析

2.1.4 驗證試驗 對最佳合成工藝進行3 次驗證試驗，產(chǎn)率分別為46.56%、46.37%、46.92%，表明該合成工藝穩(wěn)定，具有可行性。

2.2 紅外光譜分析［6］取少量白及多糖和膽甾醇琥珀酰基白及多糖，分別與溴化鉀粉末混合均勻后，壓成透明的薄片，在4 000 ～500 cm-1的范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，記錄紅外圖譜。見圖3。

圖3 白及多糖(a)，CHSB (b)的紅外圖譜

從紅外譜圖中可以看出，白及多糖含有多羥基在3 400 cm-1，衍生物樣品在約3 350 cm-1處有較強的羥基O-H 伸縮振動吸收峰，說明衍生物中有大量O-H 存在。衍生物樣品在1 741cm-1出現(xiàn)了新的吸收峰，說明有酰基修飾。樣品與白及多糖紅外數(shù)據(jù)相比較，在1 741 cm-1和1 180 cm-1處的吸收峰顯著增強，此兩處是琥珀酰基的C=O 和C-O-C的特征吸收峰，這些結(jié)果表明，膽甾醇琥珀?；晒Φ倪B接到白及多糖骨架上。

2.3 核磁共振分析

2.3.1 膽甾醇琥珀酸酯1H-NMR 表征 取5 ～10 mg CHS用CDCl3溶解加入核磁管中，采用400 MHz 液態(tài)核磁共振波譜儀測定樣品核磁共振氫譜。TMS 為內(nèi)標。見圖4。

圖4 CHS 核磁共振圖譜

根據(jù)文獻［7］ 膽固醇的特征峰(δ):0.69 (3H，s，18-H3)，0.87 (6H，d，J =9 Hz，26-H3和27-H3)，0.97(3H，d，J =7 Hz，21-H3)，1.02 (3H，s，19-H3)，3.50(1H，s，膽固醇3-H1)，5.36 (1H，m，膽固醇6-H1)。琥珀酰基特征峰(δ):2. 68 (2H，m，琥珀酰基-CH2CO )。通過上述結(jié)果表明成功合成了膽甾醇琥珀酸酯。

2.3.2 白及多糖和CHSB1H NMR 表征 取5 ～10 mg 白及多糖用DMSO 為溶劑，CHSB 用CDCl3溶解加入核磁管中，測定樣品核磁共振氫譜。TMS 為內(nèi)標。見圖5，圖6。

圖5 白及多糖核磁共振圖譜

圖6 CHSB 核磁共振圖譜

白及多糖1H-NMR 有如下特征峰(δ):5.00 (1H，s，(1，6))，5.30 (2H，d，(1，4))，2.60 ～4.80 其他所有與-OH 相連在同一碳原子上的H 以及-OH 本身H 的化學(xué)位移;CHSB 的1H-NMR 與白及多糖相比出現(xiàn)新的核磁峰0.60 ～2.40 (膽甾醇基，H)，2.60 (-OCH2CH2O-)。

2.4 膽甾醇基取代度(DS%)的測定

2.4.1 硫酸鐵銨比色法［8-9］由加入顯色劑的膽甾醇紫外掃描曲線得出溶液最大紫外吸收波長在500 nm 左右。故選擇500 nm 作為檢測波長，建立膽甾醇質(zhì)量濃度和吸光度關(guān)系的標準曲線。吸取膽固醇標準貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 分別置于10 mL 試管內(nèi)，在各管內(nèi)加入冰乙酸，使總體積達4 mL。沿管壁加2 mL 鐵礬顯色液，混勻，在30 ～50 min 內(nèi)，500 nm 波長下比色，測定吸光度值。以膽甾醇質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，吸光度值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線?；貧w方程為Y = 0.002 5X - 0.021 4，r=0.999 9。

稱取3 份CHSB 樣品，每份10 mg 分別置于25 mL 具塞試管中。加入2 mL 無水乙醇和4 mL50%氫氧化鉀溶液，65 ℃恒溫水浴振蕩皂化3 h。加入3 mL25%氯化鈉溶液，放置至室溫，加入10 mL 石油醚(30 ～60 ℃)，渦旋混勻，靜置分層。取醚層2 mL，置于10 mL 試管中，氮氣吹干，加入4 mL 冰乙酸溶解，2 mL 鐵礬顯色液，振搖，溶液立刻呈褐色，漸變紫色。30 ～50 min 內(nèi)，于500 nm 測定吸光度(A)。通過公式1 計算CHSB 中膽甾醇取代度。分別為CHSB1 -3.82%、CHSB2 -4.78%、CHSB3 -6.21%。

C，相應(yīng)的標準曲線計算出的膽甾醇的含量;m，實驗中使用的聚合物;Mcholesterol，膽甾醇基團分子質(zhì)量;MCHSB，膽甾醇基白及多糖單元的近似分子質(zhì)量。

2.4.21H-NMR 法 取5 ～10 mg 3 份CHSB 樣品用CDCl3溶解加入核磁管中，采用400 MHz 液態(tài)核磁共振波譜儀測定樣品核磁共振氫譜。由于白及多糖特征峰(δ):5.36(H(1，6))和4.62 (H(1，4))容易分辨。CHSB 圖譜中δ2.61(-OCH2CH2O-)容易分辨?？捎梅迕娣e比值來計算得到膽甾醇在白及多糖上的取代度，通過公式2［10］計算樣品膽甾醇取代度分別為 CHSB1 - 4.26%、CHSB2 - 5.22%、CHSB3 -6.52%。

3 討論

根據(jù)文獻［11］疏水改性白及多糖制備方法，經(jīng)過多次試驗測得的膽甾醇取代度值均較低，于是進行了方法學(xué)改進。文獻用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑，現(xiàn)改用二甲基亞砜(DMSO)為溶劑;文獻用三乙胺(Et3N)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)為催化劑，現(xiàn)改用4-二甲氨基吡啶(DMAP)和EDC 為催化劑。DMSO 是常用的有機溶劑中溶解能力最強的一種，它可以溶解絕大部分有機物，包括聚合物、碳水化合物、肽、無機鹽。以DMSO 為溶劑，相比較DMF 可以使白及多糖溶解的更加完全，有助于其衍生物的制備。DMAP 是廣泛用于化學(xué)合成的新型高效催化劑，結(jié)構(gòu)上供電子的二甲氨基與吡啶環(huán)，能強烈激活環(huán)上的氮原子進行親核取代，有較高的催化能力，加快反應(yīng)速度［12］。EDC 是一種水溶性碳二亞胺，常作為羧基活化劑，反應(yīng)速率高。

通過對白及多糖疏水改性合成方法的改進，以白及多糖和膽甾醇琥珀酸酯為原料，制備具有兩親性的白及多糖衍生物，產(chǎn)率由文獻的41%上升到46%。通過FT-IR 和1H NMR 對其結(jié)構(gòu)進行表征，證明合成了白及多糖衍生物。通過不同CHS 用量，制備了3 種不同取代度的CHSB 樣品。用硫酸鐵銨比色法和1H-NMR 法，測定了CHSB 樣品的膽甾醇取代度，其取代度較文獻報道有很大提高。本實驗硫酸鐵銨比色法較1H-NMR 法的測定結(jié)果略低一些。分析原因可能是核磁共振波譜儀比紫外分光光度計精密度高，還有可能是比色法樣品在前期處理中膽甾醇沒有完全從白及多糖上脫離下來，故取代度測定值偏小，但可作為參考值。

對白及多糖進行了疏水改性，使其既有親水性又有疏水性。下一步可通過溶劑擴散法、透析法或直接超聲法等制備自組裝納米聚集體，納米聚集體具有疏水內(nèi)核，可增溶一些難溶性藥物，提高其生物利用度等多種作用。取代度的不同，對納米粒性質(zhì)有很大影響，取代度高，可提高納米粒穩(wěn)定性，增加載藥量，提高包封率，取代度低，則相反。選擇適當?shù)娜軇┖痛呋瘎龠x擇適當?shù)陌准岸嗵桥c膽甾醇琥珀酸酯投料比，取得不同取代度的CHSB。改性多糖有望成為一種新型藥物載體，為藥物的增溶、緩釋、靶向等方面描繪出很好的應(yīng)用前景。

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