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        效應(yīng)面法優(yōu)化染料木素磷脂復(fù)合物制備工藝

        2015-01-13 09:23:48尹胭脂吳雪莉祝露佳王星輝
        中成藥 2015年2期
        關(guān)鍵詞:木素反應(yīng)物投料

        尹胭脂, 熊 陽 , 吳雪莉, 祝露佳, 金 琪, 王星輝

        (1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,湖南 長沙410208;2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,浙江 杭州310053)

        染料木素(genistein)亦稱金雀異黃素,主要是從大豆、葛根、槐花、染料木等豆科植物中提取出來的活性成分,是大豆異黃酮類物質(zhì)中活性最高的單一成分。它具有多種生物學(xué)活性,如抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病等,廣泛應(yīng)于制藥、保健品等領(lǐng)域,是一種很有潛力的癌癥化學(xué)預(yù)防劑,其抗癌作用具有廣泛的應(yīng)用前景。然而,染料木素的水溶性和脂溶性均較差,溶出速度慢;在胃腸道屬于被動擴散,油水分配系數(shù)小,腸滲透性差,多種因素導(dǎo)致其口服生物利用度很低[1-3]。

        研究發(fā)現(xiàn)磷脂與某些藥物形成復(fù)合物后,可改善藥物的性質(zhì)。如改變藥物的溶解性能和溶出速度,增加其表觀油水分配系數(shù),增強在胃腸道中的吸收,提高生物利用度;增強藥物的藥理作用及療效;延長藥物的作用時間;降低藥物的毒副作用;減小胃腸道刺激性等[4-5]。因此,為提高染料木素的生物利用度,本實驗將其制備成磷脂復(fù)合物。

        星點設(shè)計 (central composite rotatable design,CCRD)是近幾年來國外藥學(xué)工作者常用的集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計方法于一體的實驗設(shè)計方法,應(yīng)用已經(jīng)成熟,與國內(nèi)經(jīng)常采用的均勻設(shè)計和正交設(shè)計相比具有精確度高、預(yù)測性好、簡便等優(yōu)點[6-7]。因此,本試驗采取了星點設(shè)計結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)化染料木素磷脂復(fù)合物的制備工藝。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器 JA1003 電子天平(上海精科有限公司);電子分析天平 (奧豪斯儀器有限公司CP213);恒溫水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器制造廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);離心沉淀機(上海手術(shù)器械廠80-2);紫外分光光度計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

        1.2 藥品與試劑 染料木素和染料木素對照品(南京春秋生物工程有限公司;純度98%,批號ZL20120227);大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司);其他試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 染料木素磷脂復(fù)合物制備方法 利用染料木素不溶于二氯甲烷,而磷脂和染料木素磷脂復(fù)合物均易溶于二氯甲烷且不易被破壞的特性,本實驗采用二氯甲烷溶解反應(yīng)物分離未復(fù)合的染料木素。將一定量的染料木素和磷脂在一定條件下反應(yīng)后,減壓除去反應(yīng)溶劑,殘余物加入二氯甲烷,充分溶解磷脂及復(fù)合物,4 000 r/min 離心15 min,取上清液,去除有機溶劑后真空低溫干燥,即得染料木素磷脂復(fù)合物,為黃色略帶黏性的粉末。離心后所得的沉淀用95%乙醇溶解后,采用紫外可見光譜儀對未復(fù)合的染料木素進(jìn)行測定。

        2.2 復(fù)合率的計算方法 由于染料木素幾乎不溶于二氯甲烷,而磷脂以及磷脂復(fù)合物易溶于二氯甲烷,將制備好的磷脂復(fù)合物加入適量二氯甲烷,磷脂復(fù)合物及多余的磷脂溶于其中,離心后的沉淀即為未復(fù)合的染料木素。通過公式(1)可計算出染料木素與磷脂的復(fù)合百分率(S):

        其中M1為染料木素的初始投藥量;M2為沉淀量。

        2.3 染料木素的UV 測定方法

        2.3.1 紫外吸收波長的確定 精密稱取10 mg 染料木素對照品,無水乙醇定容至100 mL,即得100.0 μg/mL 的貯備液,將貯備液配制成4.0 μg/mL溶液,于200 ~400 nm 進(jìn)行全波長掃描。結(jié)果顯示,其最大吸收波長位于262 nm。

        2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將染料木素貯備液配制成質(zhì)量濃度為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg/mL 的溶液,以乙醇為空白,在262 nm 波長下測吸光度。建立吸光度A 與質(zhì)量濃度C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.006 9X-0.003,r =0.999 7。由此可見,染料木素在2.0 ~6.0 μg/mL 范圍內(nèi),吸光度與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好。

        2.3.3 精密度實驗 取5.0 μg/mL 的對照品溶液,1 d 內(nèi)連續(xù)測定6 次吸光度,結(jié)果RSD =0.70%,說明精密度良好。

        2.3.4 穩(wěn)定性實驗 取5.0 μg/mL 的對照品溶液,分別于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 測定染料木素含有量。結(jié)果其RSD 為0.21%,表明染料木素在3h 內(nèi)保持穩(wěn)定。

        2.3.5 回收率實驗 取已知含有量的樣品溶液6份(3.8 μg/mL),精密加入染料木素對照品(每1 mL加入相當(dāng)于4.0 μg 染料木素的貯備液),在262 nm 波長下測定吸光度。根據(jù)實測值與理論值的比值計算回收率,結(jié)果該方法的平均回收率為(98.3 ±1.36)%,RSD 為1.49%。

        2.4 單因素影響實驗

        2.4.1 反應(yīng)溶劑的選擇 設(shè)定磷脂與染料木素的投料比(m/m)為2 ∶1,反應(yīng)溫度為50 ℃,反應(yīng)時間為2 h,反應(yīng)物質(zhì)量濃度為25 mg/mL,以染料木素與磷脂的復(fù)合率為評價指標(biāo),考察四氫呋喃、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等不同反應(yīng)溶劑對復(fù)合率的影響,分別平行3 份。

        結(jié)果表明四氫呋喃作為反應(yīng)溶劑時,染料木素與磷脂的復(fù)合率較其他溶劑高,而且在試驗中發(fā)現(xiàn),相比無水乙醇,采用四氫呋喃作為溶劑得到的產(chǎn)物黏性更小,樣品更容易分散。因此后續(xù)的實驗選擇四氫呋喃作為反應(yīng)溶劑。

        2.4.2 藥物與大豆磷脂投料比的影響 反應(yīng)溶劑為四氫呋喃,其余條件同“2.4.1”項,分別考察藥輔比(染料木素與大豆磷脂的投料比)為:1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4 時的復(fù)合率,分別平行3 份。

        結(jié)果顯示藥物的結(jié)合百分率受磷脂與染料木素投料比的影響較大,隨磷脂投入量的增大而結(jié)合率增大,當(dāng)藥物與磷脂的比例為1 ∶3 時,所得復(fù)合物很黏,且攪拌后容器壁上有一些黏附物,而采用1 ∶1 的比例時,復(fù)合效果較差,1 ∶2 的比例較為適中,攪拌后容器壁上干凈,且所得復(fù)合物黏性適中,易于粉碎。

        2.4.3 反應(yīng)時間的影響 其余條件同“2.4.1”項,考察不同反應(yīng)時間(1、2、3、4 h)對藥物形成復(fù)合率的影響。分別平行3 份。

        結(jié)果表明反應(yīng)時間對復(fù)合率有一定影響,藥物與磷脂的反應(yīng)于2 h 后基本完全。超過2 h 后復(fù)合率反而有所下降。

        2.4.4 反應(yīng)溫度的影響 其余條件同“2.4.1”項,考察不同反應(yīng)溫度(30、40、50、60 ℃)下染料木素與磷脂的復(fù)合率。分別平行3 份。

        實驗結(jié)果表明,隨溫度升高,藥物的復(fù)合率有所增加。但是當(dāng)溫度高于60 ℃時,磷脂容易氧化,所以試驗的溫度不能高于60 ℃。

        2.4.5 反應(yīng)物質(zhì)量濃度的影響 其余條件同“2.4.1”項,考察不同反應(yīng)物質(zhì)量濃度(5、10、20、30 mg/mL)對復(fù)合率的影響,分別平行3 份。結(jié)果顯示反應(yīng)物質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時的復(fù)合率最高,高于或低于此質(zhì)量濃度均會使復(fù)合率降低。

        從以上實驗結(jié)果來看,影響染料木素與磷脂復(fù)合率的主要因素是反應(yīng)物質(zhì)量濃度、投料比、反應(yīng)時間,而其他因素影響不大。

        2.5 星點設(shè)計—效應(yīng)面法優(yōu)化實驗

        2.5.1 實驗設(shè)計方案 本試驗中,根據(jù)單因素的考察結(jié)果,選擇對復(fù)合率影響較大的因素作為考察因素,即反應(yīng)時間(X1)、反應(yīng)物質(zhì)量濃度(X2)、染料木素與磷脂投料比(X3),在確定各因素水平的極大(+α)和極小值(-α)以后,依據(jù)水平代碼分別求出+1、0、-1 所代表的物理量。±1、0 水平的安排遵循任意兩個物理量之間的差值與對應(yīng)代碼之間差值成等比的原則。實驗中3 個考察因素的代碼水平及對應(yīng)物理量見表1,以復(fù)合率(y)為考察指標(biāo),相應(yīng)的實驗結(jié)果見表2。

        表1 星點設(shè)計因素水平Tab.1 Factors & levels of central composite design

        表2 星點設(shè)計實驗安排及結(jié)果Tab.2 Central composite test design and results

        2.5.2 模型擬合 以復(fù)合率為響應(yīng)指標(biāo),應(yīng)用matlab 7.6 軟件,采用最小二乘法分別擬合各響應(yīng)指標(biāo)與影響因素間的一次項模型及全二次項模型。在擬合之前,先對各影響因素進(jìn)行正規(guī)化(即使Xnew = Xold/max (Xold),以消除量綱不一致)。若一次項擬合結(jié)果較為理想,則采用該模型;若響應(yīng)指標(biāo)與影響因素間的關(guān)系較為復(fù)雜,采用一次項擬合結(jié)果并不理想,則采用全二次項模型進(jìn)行擬合;最后通過比較復(fù)相關(guān)系數(shù)及P 檢驗選取較優(yōu)模型確立為最終擬合模型。對于二項式方程,根據(jù)統(tǒng)計軟件對各項系數(shù)進(jìn)行的P檢驗結(jié)果,篩除無統(tǒng)計學(xué)意義的參數(shù)(P >0.25)后,再進(jìn)行二項式方程擬合,達(dá)到模型簡化之目的。所得方程如下:

        (1)多元線性回歸方程

        y=0.723 6+0.047 7X1+0.121 2X2+0.097 0X3,(r=0.910 3,復(fù)相關(guān)系數(shù)radj=0.892 4,P <0.000 1)

        (2)全二項式方程為(準(zhǔn)入條件為P≤0.25):

        其中全二項式方程中各項系數(shù)的P 值具體如下:X1:0.188 6;X2:0.003 8;X3:0.037 1;X1X2:0.199 0;X1X1:0.243 7;X2X2:0.037 0;X3X3:0.006 1。

        由以上方程可知,全二項式擬合相關(guān)系數(shù)r 值高于多元線性回歸,擬合度高,且預(yù)測性好,實測值和預(yù)測值基本吻合(見圖1),故選擇全二項式擬合模型為最終模型。

        圖1 預(yù)測復(fù)合率與實測復(fù)合率關(guān)系圖Fig.1 Relational graph of predicted and actual recombination rate

        2.5.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 以簡化后的全二項式數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)描繪等高線圖作為效應(yīng)面,見圖2 ~4。

        圖2 投料比和反應(yīng)物質(zhì)量濃度對復(fù)合率影響的等高線圖(反應(yīng)時間為2 h)Fig.2 Contour map of the influence of weight ratio and reactant concentration on the recombination rate(the reaction time is 2 h)

        圖3 投料比和反應(yīng)時間對復(fù)合率影響的等高線圖(反應(yīng)物質(zhì)量濃度為15 mg/mL)Fig.3 Contour map of the infleunce of weight ratio and reaction time on the recombination rate (the reactant concentration is 15mg/mL)

        圖4 反應(yīng)時間和反應(yīng)物質(zhì)量濃度對復(fù)合率影響的等高線圖(投料比為1 ∶2)Fig.4 Contour map of the influence of reaction time and reactant concentration on the recombination rate(the weight ratio is 1 ∶2)

        由圖2 可知,在一定范圍內(nèi),當(dāng)投料比相同時,染料木素與磷脂的復(fù)合率隨反應(yīng)物質(zhì)量濃度的增大而增大;而當(dāng)反應(yīng)物質(zhì)量濃度相同時,復(fù)合率隨投料比的增大而增高;由圖3 可知,投料比質(zhì)量濃度較低時,反應(yīng)時間越長復(fù)合率越高,當(dāng)投料比增加到一定值時,復(fù)合率不會隨著反應(yīng)時間的延長而不斷增加,即在某一區(qū)域內(nèi)復(fù)合率增高趨勢達(dá)到平臺期;由圖4 可知,當(dāng)反應(yīng)物質(zhì)量濃度增大時,達(dá)到相同復(fù)合率所需的反應(yīng)時間越少;當(dāng)反應(yīng)時間一定時,反應(yīng)物質(zhì)量濃度越高,復(fù)合率越高,從二次項方程式可以看出,反應(yīng)物質(zhì)量濃度與反應(yīng)時間之間存在明顯的交互作用。

        2.5.4 優(yōu)化工藝及驗證 由軟件預(yù)測的最優(yōu)條件為:X1=2.1548,X2=25,X3=2 ∶3,預(yù)測的y =98.18%。為了確定建立模型與實驗結(jié)果是否相符,通過進(jìn)一步實驗對模型的可靠性進(jìn)行驗證。在預(yù)測優(yōu)選出的最佳工藝條件下制備染料木素磷脂復(fù)合物,共進(jìn)行4 組實驗,取平均值與全二項式方程優(yōu)選出的最佳工藝條件下模擬的預(yù)測值進(jìn)行比較,結(jié)果染料木素磷脂復(fù)合物復(fù)合率的實驗值為(97.57 ±1.03)%,預(yù)測值為98.18%,二者相差低于1%,說明模型是比較可靠的,實驗所得到的擬合方程可以較好地描述因素與指標(biāo)的關(guān)系。

        2.6 染料木素磷脂復(fù)合物理化性質(zhì)的測定

        2.6.1 溶解度的測定 取過量的染料木素、染料木素與磷脂的物理混合物(按照復(fù)合物的工藝配比,藥量和輔料的比例與復(fù)合物相同)、染料木素磷脂復(fù)合物,分別加入1 mL 的水、正辛醇、二氯甲烷,平行3 份,37 ℃恒溫振蕩24 h,4 000 r/min離心10 min,上清液加乙醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)進(jìn)行染料木素測定。結(jié)果見表3。

        表3 染料木素及其物理混合物、磷脂復(fù)合物在不同溶劑中的溶解度(n=3)Tab.3 Solubility of genistein and its physical mixture,phospholipid complex in different solvents (n=3)

        2.6.2 油水分配系數(shù)的測定 取適量染料木素、含染料木素的物理混合物、磷脂復(fù)合物分別溶于40 mL 水飽和的正辛醇中,放在超聲波使其溶解。離心,取上清液,留取母液。從中取10 mL 放入錐形瓶中,加入10 mL 正辛醇飽和的水,平行3 份,恒溫振蕩24 h,分別取正辛醇層、水層稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定其中染料木素含量。采用公式(2)計算Ko/w值。

        式中Co、Cw分別為藥物在正辛醇層和水層的濃度。

        計算得染料木素、含染料木素的物理混合物、磷脂復(fù)合物的油水分配系數(shù)分別為0.768 9 ±0.064 7、1.093 2 ±0.123 5、0.892 0 ±0.047 0。

        3 討論

        在工藝優(yōu)化和處方篩選過程中,常需同時考察多個因素對結(jié)果的影響,并對結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。采用固定其他因素改變某一因素的單因素考察法能收到一定效果,但也具有一定的局限性,實驗次數(shù)較多且費用較高,而且無法考察各因素間的交互作用,而因素之間的交互作用對響應(yīng)指標(biāo)的影響很大。選擇適應(yīng)于非線性擬合的試驗設(shè)計方法,可提高實驗精確度,提高優(yōu)化效果。近年來常用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法于一體的效應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行優(yōu)化,實驗設(shè)計采用中心組成設(shè)計 (central composite design,CCD)[7-8],它能以較少的實驗次數(shù)對各因素的效應(yīng)進(jìn)行非線性估計,并能通過求得的考察指標(biāo)與各因素間的關(guān)系式和效應(yīng)面,確定在試驗范圍內(nèi)的各因素的最佳值,反映各因素及因素間的相互作用對指標(biāo)值的影響程度。從本實驗的單因素考察中無法看出各因素之間的交互作用,而采用星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法,不僅可以得到單個因素對指標(biāo)的影響及影響程度,還得到了各主要因素之間的交互作用,從而取得了較好的實驗結(jié)果。

        由染料木素及磷脂復(fù)合物的理化性質(zhì)可知,將染料木素制備成磷脂復(fù)合物后,即提高了它在水中的溶解度,同時也提高了其在有機溶劑中的溶解度。相對于染料木素、染料木素和磷脂的物理混合物在水中溶解度均略有提高,這是由于磷脂是屬于表面活性劑,可以在一定程度上起到增溶作用。而在二氯甲烷和正辛醇中也有所提高,可能是由于染料木素在與正辛醇、二氯甲烷攪拌的過程中,也有部分形成了磷脂復(fù)合物的形式,或者是由于溶解了磷脂的有機溶劑本身對于染料木素的溶解行為就有所改變。但相對于磷脂復(fù)合物,物理混合物在水中和有機溶劑中的溶解度均沒有磷脂復(fù)合物提高的多。據(jù)報道,黃酮類成分等與磷脂的極性基團(tuán)部分可以發(fā)生較強的相互作用,抑制了分子中單鏈的自由轉(zhuǎn)動,而磷脂的兩個長鏈脂肪酸鏈不參與復(fù)合反應(yīng),可自由移動,包裹了磷脂的極性部分形成一個親脂性的表面,使復(fù)合物表現(xiàn)出較強的脂溶性[10]。

        從油水分配系數(shù)的結(jié)果可知,磷脂復(fù)合物在正辛醇/水系統(tǒng)的油水分配系數(shù)相比染料木素有所提高,但不如物理混合物提高的多,原因可能是由于磷脂復(fù)合物同時提高了染料木素在水中和正辛醇中的溶解度,但正辛醇和水中溶解度提高倍數(shù)之間的比例不如物理混合物大。

        藥物的油/水分配系數(shù)與藥物在生物膜中的分配有關(guān),油水分配系數(shù)在一定范圍內(nèi)的增大,會使藥物進(jìn)入生物膜的量增大,有利于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運,從而使進(jìn)入體內(nèi)的藥物量增加,生物利用度提高[10]。染料木素磷脂復(fù)合物油水分配系數(shù)的增大,預(yù)示其體內(nèi)吸收有可能得到提高。但和物理混合物相比,是否可以顯著提高還有待進(jìn)一步研究。

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