李元輝

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橙皮素的大鼠血漿蛋白結(jié)合率研究

李元輝

目的 測定橙皮素的大鼠血漿蛋白結(jié)合率。方法 采用平衡透析法結(jié)合高效液相色譜法(HPLC)對橙皮素與大鼠血漿的血漿蛋白結(jié)合率進行測定。結(jié)果 在0.5、2.5和10 μg/mL濃度水平橙皮素與大鼠血漿的血漿蛋白結(jié)合率分別為(93.5 ± 4.2)%，(94.3 ± 5.6)%和(93.9 ± 3.8)%，三個濃度水平之間的血漿蛋白結(jié)合率差異無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。結(jié)論 橙皮素與大鼠血漿蛋白高度結(jié)合。

橙皮素；血漿蛋白結(jié)合率；大鼠；平衡透析法；高效液相色譜法

0 引言

橙皮素(Hesperetin)是一種二氫黃酮，存在于橙類、檸檬、荊芥、豬殃、佛手等植物中，在自然界多以連接一個蕓香糖的橙皮苷形式存在，而橙皮苷口服給藥后，在腸道水解酶或腸道菌群代謝成橙皮素吸收進入體內(nèi)而發(fā)揮作用［1-3］。橙皮素具有廣泛的藥理活性，如抗脂質(zhì)氧化、清除氧自由基、抗炎、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、防輻射、保護心血管系統(tǒng)等藥理活性［4-7］。

血漿蛋白結(jié)合率是藥動學的重要參數(shù)之一，它直接影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄，從而影響藥物的作用強度和時間，并且與藥物的相互作用及作用機制等密切相關［7-9］。但目前為止，關于橙皮素和橙皮苷的血漿蛋白結(jié)合率研究的文獻報道很少。由于橙皮苷在體內(nèi)主要以橙皮素的形式存在，因此，本研究采用平衡透析法研究了橙皮素的大鼠血漿蛋白結(jié)合率，旨在為含橙皮素和橙皮苷制劑的藥物相互作用研究及臨床合理應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 1200高效液相色譜儀，包括真空脫氣機、自動進樣器、UV檢測器、柱溫箱、四元泵及Chem Station色譜工作站(美國Agilent Thermo公司)；TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sarterius BS210S型電子天平；ZHWY-2101C型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器有限公司)；透析袋(規(guī)格：MD25，截留范圍8 000～14 000，北京鼎國生物技術有限責任公司)。

橙皮素對照品(097K1153，HPLC純度≥98%)和柚皮素對照品(127K1240，內(nèi)標，HPLC純度≥98%)，均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純，購于Fisher公司；氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸等試劑均為分析純；娃哈哈純凈水。

1.2 動物 健康SD大鼠6只，雄性，體重(220±10.0) g，由北京大學實驗動物中心提供。實驗前動物禁食過夜，自由飲水。大鼠尾靜脈取血，置肝素抗凝離心管中，3 500 r/min離心5 min，分離血漿，混合，備用。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取橙皮素對照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成濃度為1.0 mg/mL的儲備液。精密吸取該儲備液1.0 mL，用甲醇稀釋至10 mL，配成濃度為100 μg/mL的工作溶液。吸取該溶液適量，以甲醇為溶劑進行一系列稀釋，得到系列濃度的對照品溶液和低、中、高(0.25、2.5、12 μg/mL)3個濃度的質(zhì)控(QC)溶液。

2.1.2 內(nèi)標溶液的配制 精密稱取柚皮素對照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成濃度為1.0 mg/mL的儲備液。精密吸取該儲備液1.0 mL，用甲醇稀釋至10 mL，配成濃度為100 μg/mL的內(nèi)標工作溶液。

2.1.3 空白透析液的配制 精密稱取磷酸氫二鉀14.11 g，磷酸二氫鉀2.59 g，氯化鈉1.99 g，以適量超純水溶解，以水補至1 000 mL，得pH 7.4磷酸緩沖液作為空白透析液。

色譜柱為Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 m)；流動相為甲醇(A)和20 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(以磷酸調(diào)節(jié)pH至2.0)(B)，梯度洗脫，程序為：0～8 min，40∶60～50∶50；8～16 min，50∶50～60∶40；16～20 min，40∶60(v/v)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為288 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 樣品預處理

2.2.1 透析內(nèi)液樣品預處理 準確吸取透析內(nèi)液100 μL，置于10 mL具塞玻璃試管中，加入50 μL內(nèi)標溶液(1.0 μg/mL)和50 L甲醇，混勻，然后加入200 μL乙醇，搖勻，再加入600 μL二氯甲烷，振搖30 s，3 500 r/min離心10 min，取上層有機層600 μL，于45 ℃水浴中氮氣流吹干，殘余物用流動相(40∶60)100 μL復溶，取10 μL進行HPLC分析。

2.2.2 透析外液樣品預處理 準確吸取透析外液100 μL，置于1.5 mL具塞試管中，加入50 μL內(nèi)標溶液(1.0 μg/mL)和50 L甲醇，混勻，取10 μL進行HPLC分析。

2.3 分析方法驗證考察

2.3.1 標準曲線 取空白血漿或空白透析液100 L，加入橙皮素標準品系列溶液50 L，配制相當于空白血漿或空白透析液中濃度為0.1、0.25、0.75、2.5、7.5和15 μg/mL的樣品，按“2.2”項下方法操作，建立工作曲線。用加權(quán)最小二乘法［10］以橙皮素與內(nèi)標的峰面積比值(Y)對濃度(C)作圖，并計算直線回歸方程。

2.3.2 準確度與精密度 取空白血漿100 L，按“2.3.1”項下方法操作，配成低、中、高3個濃度(0.25、2.5和12 μg/mL)的QC樣品。考察方法的日內(nèi)和日間精密度(RSD，%)和準確度(RE，%)。每一濃度平行5樣本分析，連續(xù)測定3 d。計算準確度和日內(nèi)、日間精密度。

2.3.3 提取回收率 取空白血漿100 L，按“2.3.1”項下方法操作，配成低、中、高3個濃度(0.25、2.5和12 μg/mL)的QC樣品，每個濃度3個樣本，按“2.3”項下方法處理，按“2.2”項下高效液相色譜條件分析，考察方法的提取回收率。

2.3.4 穩(wěn)定性 取空白血漿100 L，按“2.3.1”項下方法操作，配成低、中、高3個濃度(0.25、2.5和12 μg/mL)的QC樣品，每個濃度3個樣本，按“2.3”項下方法處理，按“2.2”項下高效液相色譜條件分析，考察血漿樣品處理后室溫放置4 h和-20 ℃保存1周的穩(wěn)定性。

2.4 血漿蛋白結(jié)合率測定 將透析袋剪成約10 cm左右的小段，放于蒸餾水中，煮沸5 min，再用約60 ℃水沖洗2 min，用少量緩沖液沖洗后于緩沖液中浸泡備用。取處理過的透析袋一端用線折疊結(jié)扎，將2 mL空白血漿加到透析袋內(nèi)，折疊后結(jié)扎，其中保留少量空氣。將該透析袋懸浮于盛有20 mL緩沖液的廣口瓶中，膜外緩沖液中橙皮素的濃度分別為0.5、2.5和10 μg/mL。將透析袋內(nèi)外液面調(diào)節(jié)至同一水平面，并避免透析袋貼于瓶壁。將瓶口密封后，于(37±1)℃水浴中持續(xù)振蕩24 h至藥物擴散平衡。透析結(jié)束后，使用10%高氯酸溶液檢查透析外液有無蛋白漏出，有漏出者視為作廢。平衡結(jié)束后，分別吸取袋內(nèi)、袋外樣本，按“2.3”項下方法處理，按“2.2”項下高效液相色譜條件分析，并使用下列公式計算血漿蛋白結(jié)合率：蛋白結(jié)合率= (Dt-Df)×Dt100%，其中，Dt為袋內(nèi)血漿中藥物的濃度，Df為袋外透析液中藥物的濃度。每個濃度水平重復試驗4次。

3 結(jié)果

3.1 方法學驗證結(jié)果 在本研究條件下，空白血漿和空白透析液不干擾橙皮素及內(nèi)標的測定(見圖1)。在空白血漿或空白透析液中，橙皮素在0.1～15.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，典型回歸曲線分別為Y = 10.252 C + 0.29(r=0.996)和Y= 11.961 C + 0.384 c，方法的定量下限為0.1 μg/mL。該方法的精密度和準確度結(jié)果符合要求(見表1)。在低、中、高3個濃度下橙皮素的回收率分別為(86.4±4.5)%、(83.5±6.7)%和(87.8±3.5)%。穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示，在各種條件下，低、中、高3個濃度水平的橙皮素QC樣品的RSD均小于15%，表明血漿樣品在室溫放置4 h和-20 ℃保存1周穩(wěn)定。

圖1 袋內(nèi)血漿中橙皮素的典型HPLC色譜圖

內(nèi)樣品；Ⅰ.內(nèi)標，Ⅱ.橙皮素

表1 準確度和精密度測定結(jié)果

濃度(μg/mL)添加測定準確度(RE,%)精密度(RSD,%)日間日內(nèi)0.250.23-8.06.02.42.52.50.06.37.512.011.8-1.75.710.8

3.2 透析平衡時間的確定 將處理過的透析袋一端扎緊，吸取1.0 mL空白血漿加入透析袋內(nèi)，將透析袋另一端扎緊，使其懸浮于盛有20 mL含藥緩沖液(2.5 μg/mL)的廣口瓶中。密封瓶口后，將其置于(37±1)℃水浴中，持續(xù)振蕩，分別在12、24、36和48 h吸取透析袋內(nèi)外液100 L進行HPLC分析，測定透析袋內(nèi)、外液的濃度，以當日標準曲線計算透析袋內(nèi)外橙皮素的濃度，二者比值恒定即認為藥物在袋內(nèi)外自由擴散達到平衡。結(jié)果顯示，24 h時袋內(nèi)、外溶液中橙皮素的質(zhì)量濃度相等，表明擴散24 h己達到平衡，因此設定平衡透析時間為24 h。

3.3 橙皮素大鼠血漿蛋白結(jié)合率 橙皮素的大鼠血漿蛋白結(jié)合率測定結(jié)果見表2。由表2可見，橙皮素與大鼠血漿蛋白高度結(jié)合。采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對3個濃度水平下的血漿蛋白結(jié)合率進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在不同濃度水平下橙皮素與大鼠血漿的血漿蛋白結(jié)合率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 橙皮素的大鼠血漿蛋白結(jié)合率

藥物濃度(μg/mL)血漿蛋白結(jié)合率(%)0.593.5±4.22.594.3±5.610.093.9±3.8

4 討論

血漿蛋白結(jié)合率的研究方法主要有平衡透析法、超濾法、超速離心法和凝膠過濾法等，其中平衡透析法是研究血漿蛋白結(jié)合率的經(jīng)典方法，操作簡單、經(jīng)濟［8］，因此本研究采用該方法來測定橙皮素的血漿蛋白結(jié)合率。

藥物與血漿蛋白之間的結(jié)合反應不僅關系到藥物在體內(nèi)的分布和消除，還與藥物相互作用密切相關。橙皮素屬于黃酮類化合物，生物活性確切、藥理作用廣泛。盡管橙皮素的治療指數(shù)高，不良反應小，但根據(jù)本研究的結(jié)果，橙皮素具有較高的血漿蛋白結(jié)合率，因而含橙皮素或橙皮苷制劑在與其他血漿蛋白結(jié)合率高的藥物聯(lián)合應用時，有可能發(fā)生血漿蛋白競爭性結(jié)合，導致后者的血藥濃度增加，因而該類制劑在與其他治療窗窄、不良反應大的藥物聯(lián)合應用時，有必要監(jiān)測后者的血藥濃度或觀測患者的治療反應，以免發(fā)生藥物中毒反應。

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Study on plasma protein binding rate of hesperetin in rat′ plasma

LI Yuan-hui

(Sinopharm Group Co.,Ltd.,Beijing 100077，China)

Objective To determine the rats′ plasma protein binding rate of hesperetin.Methods The equilibrium dialysis method combined with HPLC was used to determine the plasma protein binding rate of hesperetinin rats.Results The plasma protein binding rates of hesperetin in rats at the concentration of 0.5,2.5 and 10 μg/mL were (93.5 ± 4.2)%,(94.3 ± 5.6)% and (93.9 ± 3.8)% respectively,and there was no significant difference among these concentration levels(P≥0.05).Conclusion Hesperetin is highly bound to rats′ plasma protein.

Hesperetin; Plasma protein binding rate; Rat; Equilibrium dialysis；HPLC

2015-04-21

國藥集團藥業(yè)股份有限公司，北京 100077

10.14053/j.cnki.ppcr.201509020