張先廷

(忻州師范學(xué)院，山西 忻州 034000)

實(shí)驗(yàn)室與分析

吡哌酸荷移反應(yīng)及熒光光譜性質(zhì)研究

張先廷

(忻州師范學(xué)院，山西 忻州 034000)

研究了吡哌酸（PPA）與2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌(CAA)之間的荷移反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，二者在丙酮-甲醇介質(zhì)中發(fā)生荷移反應(yīng)，在 35℃恒溫40min即可生成絡(luò)合比為1∶1的荷移絡(luò)合物，其熒光發(fā)射比吡哌酸（PPA）有顯著增強(qiáng)。溶液濃度在0.10～7.0μg·mL-1范圍內(nèi)荷移絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度與濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9993，檢出限為0.10μg·mL-1。該方法用于吡哌酸（PPA）膠囊的測(cè)定，加標(biāo)回收率為97.1%～99.0 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%～2.9%。

荷移反應(yīng)；2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌；熒光光譜性質(zhì)；吡哌酸

吡哌酸（Pipemadic Acid）別名吡卜酸，化學(xué)名為8-乙基-5-氧代-5,8-二氫-2-(1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸[1-4]，是20世紀(jì)80年代進(jìn)入臨床的一種吡啶酮酸類抗菌藥物，主要治療泌尿路、膽道、腸道及耳鼻等部位的感染。有關(guān)分析PPA文獻(xiàn)主要有分光光度法[5]、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[6]、高效液相色譜法[7]、電化學(xué)法[8]。本文著重介紹了PPA與2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌發(fā)生荷移反應(yīng)的條件、反應(yīng)機(jī)理及生成絡(luò)合物的熒光光譜性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)PPA在一定條件下，極易與2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌發(fā)生荷移反應(yīng)，形成1∶1的紫色絡(luò)合物，且熒光發(fā)射特征光譜明顯增強(qiáng)并紅移，從而建立了高靈敏度測(cè)定PPA的新方法，并成功地測(cè)定了膠囊中PPA含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

日立F-4500熒光光度計(jì)，SHA-Ⅱ恒溫水浴器。

PPA標(biāo)準(zhǔn)品:精密稱取0.0122g PPA用CH3OH溶解并定容在100mL的容量瓶中，得到濃度為2.0×10-4mol·L-1的儲(chǔ)備液，用時(shí)稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

用甲醇配制成4.0×10-3mol·L-12,5-二羥基-3,6-二氯苯醌（CAA）甲醇溶液。所用試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

用移液管在10mL的比色管中分別準(zhǔn)確移取一定量的PPA甲醇溶液和1.0mL的2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌甲醇溶液，用丙酮定容至刻度并封塞，搖勻后置于恒溫35℃水浴中加熱40min。從中取適量于10mm的石英熒光池，調(diào)整光譜狹縫（EX/EM）均為 2.5nm，分別在λex=337nm、λex=332nm、λex=429nm、λex=411nm處測(cè)定荷移絡(luò)合物和空白試驗(yàn)下PPA的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜結(jié)果分析

按上述實(shí)驗(yàn)方法，分別對(duì)PPA與2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌荷移反應(yīng)絡(luò)合物和PPA進(jìn)行熒光測(cè)定，所得結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，PPA自身發(fā)射熒光強(qiáng)度較為微弱，其激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別位于337nm和411nm。而加入2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌后，熒光發(fā)射峰較PPA紅移了18nm，同時(shí)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了近10倍，這種熒光光譜特征的變化充分證明PPA與2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌發(fā)生荷移反應(yīng)，生成了新的荷移絡(luò)合物。

2.2 反應(yīng)溫度選擇

按1.2實(shí)驗(yàn)方法，分別測(cè)定20～55℃的水浴中PPA與2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌的荷移反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度從20℃起，隨溫度升高所得產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，到35℃后熒光強(qiáng)度隨溫度變化不大，40℃以后熒光強(qiáng)度開始減弱。同時(shí)考慮到有機(jī)溶劑的揮發(fā)對(duì)定量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，故溫度條件控制在35℃為最佳。

圖1 PPA和PPA-CL 激發(fā)和發(fā)射譜圖Fig1 Excitation and emission spectra of PPA and PPA-CAA

2.3 反應(yīng)時(shí)間選擇

在恒溫35℃下，分別對(duì)20～60mim內(nèi)不同時(shí)間段荷移反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光光譜考察[9-11]，發(fā)現(xiàn)40min為最佳反應(yīng)時(shí)間。將荷移反應(yīng)絡(luò)合物室溫下放置60min，再進(jìn)行熒光測(cè)定，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化，說明荷移絡(luò)合物在室溫下較為穩(wěn)定[12]。

2.4 反應(yīng)介質(zhì)選擇

在水浴恒溫35℃條件下，分別試驗(yàn)了荷移反應(yīng)在丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇、乙睛、三氯甲烷等溶劑中反應(yīng)40min后，所得荷移絡(luò)合物熒光強(qiáng)度的變化。發(fā)現(xiàn)在丙酮介質(zhì)中所得荷移絡(luò)合物的熒光最強(qiáng)，同時(shí)考慮到2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌在甲醇中的溶解度最大，因此考察了不同比例的甲醇、丙酮混合介質(zhì)中生成的荷移絡(luò)合物的熒光發(fā)射強(qiáng)度，最終確定甲醇和丙酮的體積比為1∶9為最佳。

2.5 試劑用量選擇

按1.2實(shí)驗(yàn)方法，分別考察了2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌甲醇液用量為0.4～2.0mL時(shí)對(duì)反應(yīng)荷移絡(luò)合物熒光強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn)2,5-二羥基-3,6-二氯苯醌甲醇液的用量為1.0mL時(shí)效果最佳。

2.6 賦形劑干擾實(shí)驗(yàn)

在所確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，按照1.2實(shí)驗(yàn)方法，做藥品賦形劑對(duì)PPA測(cè)定的干擾試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在200倍的淀粉、葡萄糖、果糖、β-環(huán)糊精、蔗糖、乳糖、硬脂酸鎂等共存的條件下，均不影響測(cè)定結(jié)果。

2.7 線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

最佳條件下，按1.2實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)系列濃度的PPA甲醇溶液，進(jìn)行熒光光譜測(cè)定，并以熒光發(fā)射強(qiáng)度對(duì)PPA的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.12～7.4μg·mL-1范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與PPA濃度之間線性回歸方程為F=141.51C+1.198，相關(guān)系數(shù)r=0.9994。同樣方法測(cè)定空白溶液11次，由貝塞爾公式法計(jì)算方法的檢出限（3s/k）為0.12μg·mL-1。

2.8 荷移絡(luò)合物形成機(jī)理初探

荷移絡(luò)合物又稱電子供體-受體復(fù)合物，屬于超分子化合物的一種，指由富電子（donor，簡(jiǎn)稱D分子）和缺電子（acceptor，簡(jiǎn)稱A分子）的2種分子形成的一類絡(luò)合物[13-16]。吡哌酸（PPA）分子中哌嗪基上的4′-N原子上存在著一對(duì)孤電子，具有較高的電子云密度和較弱的空間阻礙作用，可作為n電子供體[17-20]，而CAA是一個(gè)具有空的反鍵軌道的共軛體系，分子的剛性強(qiáng)、共平面性強(qiáng)，并連有吸電子基—氯原子，整個(gè)分子的電子密度低，缺電子能力強(qiáng)，是個(gè)很好的π電子受體[21]，因此在醇酮溶液中形成n-π型荷移絡(luò)合物。用摩爾比法和等摩爾連續(xù)變化法測(cè)定絡(luò)合物的組成比[22]為1∶1?；谝陨蟽牲c(diǎn)反應(yīng)可表示為:

3 樣品測(cè)定

3.1 供試品溶液的制備

取20粒PPA膠囊（每粒標(biāo)示量250mg），按文獻(xiàn)[23]的方法處理，仔細(xì)研碎混合均勻，然后準(zhǔn)確稱取適量（含PPA約250mg）的內(nèi)容物藥粉，用甲醇液定容至250mL容量瓶中，搖勻過濾，準(zhǔn)確移取濾液適量稀釋100倍供用。

3.2 樣品含量測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)

取3批樣品按照3.1的試驗(yàn)方法處理，取樣品液適量，按實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件和方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算求得樣品中PPA的含量。精密稱取PPA對(duì)照品適量加入到一定量的樣品液中，按以上方法配制溶液測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算回收率[24-25]，結(jié)果見表1。

表1 樣品分析結(jié)果（n =5）Table 1 Analytical results of pipemidic acid in the samples (n= 5)

4 結(jié)語

荷移反應(yīng)應(yīng)用于藥物分析中，具有專屬性強(qiáng)、增敏效果顯著等特點(diǎn)，既適用于單一藥物的測(cè)定，又可用于復(fù)方藥物的分析，大大拓展了熒光光譜法研究藥物的范圍。這方面研究的不斷深入，使得藥物檢測(cè)方法更靈活多樣、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便。

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Study on Fluorescence Spectroscopy of Pipemidic Acid based on Charge-transfer Reaction

ZHANG Xian-ting
(College of Professional Training,Xinzhou Normal University, Xinzhou 034000, China)

The reaction based on charge-transfer reaction between pipemidic acid (PPA) and 2, 5-dyhydroxyl-3,6-dichlorobenzene quinine (CAA) was studied. As a result, those two compounds could initiate charge transfer reaction with each other at 35℃ within 40min to form a new complex with 1∶1 mode in the acetone-methanol medium. Compared to pipemidic acid (PPA), this new complex had remarkable f uorescence enhancement. Fluorescence intensity f t great linear with the concentration of complex when the concentration was within the scope of 0.10～7.0 μg/mL, the correlation coeff cient r=0.9993, detection limit was 0.10μg/mL. This method could be used to detect the pipemidic acid (PPA) capsules, recovery rate was 97.1%～99.0% and relative standard deviation (RSD) was 1.2%～2.9%.

charge-transfer reaction; 2,5-dyhydroxyl-3,6-dichlorobenzene quinine; f uorescence characteristics; pipemidic acid

O 657.3

A

1670-9905(2015)05-0046-04

張先廷(1970-)，男，山西繁峙人，碩士研究生，講師，主要從事分析化學(xué)研究工作

2015-03-10