張 宇，李 婷，楊 建，趙 潔，賀建宇＊，陳 琦（.西安交通大學藥學院，西安 7006；.武警總部機關門診部，北京 00089；3.西安交通大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，西安 70004）

白芷中有效成分的篩選、分析及對大鼠血管活性的影響

張 宇1，李 婷1，楊 建2，趙 潔1，賀建宇1＊，陳 琦3＊（1.西安交通大學藥學院，西安 710061；2.武警總部機關門診部，北京 100089；3.西安交通大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，西安 710004）

目的 對白芷中有效成分歐前胡素和異歐前胡素進行篩選和鑒定，并考察其對大鼠血管活性的影響。方法 利用細胞膜色譜法（CMC）和氣質聯(lián)用法（GC／MS）對白芷中的有效成分進行篩選和鑒定，篩選過程采用大鼠動脈細胞膜色譜柱（50mm× 1.0mm），37℃條件下用pH 7.4的磷酸鈉緩沖液作為流動相，通過大鼠離體腹主動脈環(huán)實驗對活性成分進行研究。結果 歐前胡素和異歐前胡素在大鼠動脈細胞膜制成的細胞膜色譜系統(tǒng)中，能夠產(chǎn)生與維拉帕米類似的藥理作用。這2種成分能夠顯著抑制由重酒石酸去甲腎上腺素（NE）和氯化鈣（CaCl2）誘導的血管收縮作用。結論 在用白芷治療血管疾病過程中，歐前胡素和異歐前胡素將作為2種主要發(fā)揮藥理作用的有效成分。

白芷；歐前胡素；異歐前胡素；細胞膜色譜法；抑制作用

白芷為分布于中國整個地區(qū)的多年生草本植物，其根部常常作為鎮(zhèn)定和止痛藥。白芷治療頭痛療效顯著，并且其膠囊劑可以促進血液循環(huán)［1－4］。白芷中的香豆素類化合物的化學結構和藥理作用已經(jīng)得到了廣泛的研究［5］。其主要有效成分是歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素等香豆素類［6］。藥理學研究和臨床實驗表明，這些成分具有顯著的抗癌、殺菌和鎮(zhèn)痛作用［7－9］，經(jīng)常被用作白芷藥材及其產(chǎn)品質量控制過程中的參考標準。根據(jù)文獻報道，白芷或其他植株中含有的歐前胡素和異歐前胡素具有抑制GABA－轉移酶、抗真菌、預防肝癌和誘導細胞色素C依賴的細胞凋亡等作用［10－13］，但其舒張血管作用的機制至今尚不明確。

本實驗采用大鼠動脈從白芷原料藥中提取并篩選分離活性化合物。其中細胞膜色譜法作為篩選方法［14］。用高效液相色譜法進行分離，可使歐前胡素和異歐前胡素2種成分各自達到質量分數(shù)超過98%。采用離體藥理學方法研究其對大鼠動脈血管環(huán)活性的作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters高效液相色譜（Waters 486可調節(jié)紫外吸收檢測器，Waters 510泵）；細胞膜色譜柱（50mm×1.0mm）；采用Anastar高效液相色譜工作站進行數(shù)據(jù)分析（Dochrom，中國，天津）；GC／MS系統(tǒng)（GC／MS－QP2010Shimadzu，Kyoto，Japan），采用一個DB－5MS毛細管色譜柱（30m×0.32mm，0.25μm膜厚度，Agilent Technologies，USA）；NIST譜庫（島津，日本）進行數(shù)據(jù)分析；AUY220型分析天平（日本島津）；SB－2200型超聲波清洗機（上海必信超聲波儀器廠）；DMT血管張力測試系統(tǒng)（丹麥）。

1.2 試藥 HPLC級甲醇，正己烷，乙酸乙酯（AcOEt），二甲基亞砜（Pittsburg，PA，USA），氦（純度，99.999%，購于西安分析儀器廠）；硅膠（ZEX－Ⅱ，100－200目，青島海洋化工有限公司）；重酒石酸去甲腎上腺素（NE）（武漢制藥有限公司）；維拉帕米（Sigma－Aldrich USA）；白芷（購于西安中藥材市場，經(jīng)鑒定）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物 SD大鼠（雄性或雌性，225～275g），由西安交通大學動物實驗中心提供。

2 方法

2.1 大鼠動脈細胞膜色譜柱制備 鼠動脈細胞膜固定相制備法參照前期文獻報道方法［15］。固定相的酶生物學活性作為細胞膜色譜法的一項特殊的細胞膜指標參照文獻進行設定［16］。大鼠動脈細胞膜色譜柱（50mm×1.0mm）成功裝柱。

2.2 細胞膜色譜法篩選 用大鼠動脈細胞膜色譜柱與Waters高效液相色譜制成色譜系統(tǒng)，用于從白芷中篩選生物活性成分。流動相為50mmol·L－1的磷酸鈉緩沖液（pH 7.4），流速為0.5mL·min－1。檢測波長為236nm，柱溫37℃。樣品通過大鼠動脈細胞膜色譜系統(tǒng)在上述色譜條件下進行篩選。采用Anastar高效液相色譜工作站進行數(shù)據(jù)分析。

2.3 GC／MS過程 GC／MS系采用一個DB－5MS毛細管色譜柱，進樣口溫度控制在300℃。柱溫箱140℃加熱2min，以10℃·min－1的速度從140℃程序升溫到280℃，保持恒溫4min。載氣（氦氣）流速為2.0mL·min－1。1.0μL樣品溶液以1∶10分流比注入色譜系統(tǒng)進行分析，GC／MS solution軟件收集數(shù)據(jù)。電子轟擊電離質譜：70eV電離電壓，離子源溫度為200℃，使用掃描模式在質量范圍為40.0～400.0測量總離子色譜圖（TIC）。在NIST譜庫進行數(shù)據(jù)分析。

2.4 提取和分離 取白芷粉碎成40目，用乙醇提取。將萃取液重懸浮于水中，用石油醚、乙醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3次。各餾分在真空中蒸發(fā)，得到白芷5種不同極性部分。

在石油醚中的一部分使用柱層析（CC）進行系統(tǒng)地分離。10g樣品裝載于正相色譜柱（硅膠，3× 200g）上，用石油醚－乙醚的混合溶液，從比例為5∶1到1∶1進行洗滌。重組后獲得8種餾分（5× 100mL每餾分）。餾分1（1.5g），用石油醚－乙醚（5∶1）作為流動相，用正相色譜柱（硅膠，3×100g）進行進一步地分離，15個餾分（5×100mL每餾分）在重組后獲得。從餾分1～5和餾分1～9獲得2種針狀結晶物質（質量分數(shù)＞98%，用HPLC和TLC）。

2.5 離體藥理學 大鼠用乙醚麻醉后采用斷頸處死，立即取出腹主動脈并浸潤在用119mmol·L－1氯化鈉、15mmol·L－1碳酸氫鈉、4.6mmol·L－1氯化鉀、1.2mmol·L－1氯化鎂、1.2mmol·L－1磷酸二氫鈉、1.5mmol·L－1氯化鈣和5.5mmol·L－1葡萄糖組成的（4℃）標準緩沖溶液中。腹主動脈須從粘連組織中分離，在低溫標準緩沖溶液切割成長度為1mm的片段。在溫控（37℃）緩沖溶液（1mL）中進行血管收縮抑制作用的實驗。將緩沖溶液連續(xù)地通入CO2占體積分數(shù)5%的O2混合氣中，維持pH為7.45。該血管環(huán)被固定在2個L形金屬插腳上。一端插腳連接到力－位移傳感器（FT－03，Grass Instr.，Quincy，USA）上，該傳感器接通PowerLab系統(tǒng)單元（AD儀表，英國Hastings）并通過Chart○R軟件（AD Instruments，Hastings，UK）連續(xù)記錄等長收縮力。另一端插腳連接到一個移位裝置，用于調整2個平行的插腳之間的距離。對血管環(huán)施加5mN的外力，在此張力水平下穩(wěn)定1h。每個血管環(huán)的收縮力是通過置于富含鉀的緩沖溶液（60mmol·L－1）來測定，該緩沖溶液與標準緩沖溶液相比，僅僅是由等濃度的氯化鉀代替了氯化鈉，而其余溶液組成部分相同。只有氯化鉀的收縮大于1.0mN并具有重復性的血管環(huán)才能用于實驗。當氯化鉀緩沖溶液能誘導2次重復性收縮時，則該血管環(huán)可用于進一步的研究。通過累積添加NE可得到不同濃度的化合物的濃度－反應曲線［17－19］。

在實驗中，這些血管環(huán)在含Ca2＋的緩沖溶液中進行孵育，而這種緩沖溶液的組成與標準緩沖液的組成，除了氯化鈣被等濃度的氯化鈉代替以外，其他成分相同，而且累積加入氯化鈣（終濃度為10mmol·L－1）使血管環(huán)收縮。其他過程與上述相同。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)是由Graph Pad Prism 4.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。通過NE或CaCl2累積應用獲得濃度－反應曲線。收縮反應是以歐前胡素和異歐前胡素的NE（或CaCl2）誘導的最大收縮的百分比，并且n是指大鼠腹主動脈環(huán)區(qū)段的數(shù)目。pD2′值是由每種化合物的不同濃度的Emax值計算的。

3 結果

3.1 餾分和化合物的分離和篩選 從白芷中得到的乙醇提取物和其他分離的樣本（餾分和化合物），由硅膠柱分離并經(jīng)過大鼠動脈細胞膜色譜法篩選后獲得。將乙醇提取物使用液－液萃取，分離成5個部分。

如圖1所示，在CMC體系中通過石油醚篩選具有生物活性的組分，采用硅膠柱進行進一步分離，以便于得到純化合物。約有8種餾分可通過大鼠動脈細胞膜色譜系統(tǒng)進行篩選。在所有餾分中，餾分1～5（化合物A）和餾分1～9（化合物B）是能作用于大鼠動脈細胞膜的活性成分。如圖2所示，通過高效液相色譜法分離后，化合物A和化合物B是白芷中的主要成分，而且這2種化合物的純度（質量分數(shù)＞98%）高度滿足結構鑒定和藥理學實驗標準。

3.2 化合物A和B的化學結構 化合物A和B的總離子色譜圖根據(jù)EIMS色譜圖獲得?；衔顰的主要碎片和裂解規(guī)則如下所示（m／z）：270（M＋），202，174，146，69等。化合物B的主碎片和裂解規(guī)則為（m／z）：270（M＋），202，174，145，69等。化合物A和化合物B分別顯示出了對應于分子式為C16H14O4和C16H14O4準分子離子。由中國國家藥品和生物制品研究所提供的標準物質，通過NIST譜庫中的質譜數(shù)據(jù)進行比對分析，鑒定化合物A和化合物B分別為歐前胡素［9－（3－甲基－丁－2－烯氧基）－7 H－呋喃并［3，2－g］苯并吡喃－7－酮］和異歐前胡素［4－（3－甲基－丁－2－烯氧基）－7 H－呋喃并［3，2－g］苯并吡喃－7－酮］（如圖3和圖4所示）。

圖1 5種成分的細胞膜色譜圖a.空白對照；b.維拉帕米；c.石油醚；d.化合物A；e.化合物B；1.維拉帕米；2.石油醚；3.歐前胡素；4.異歐前胡素Fig.1 The CMC chromatogramsa.blank；b.verapamil；c.petroleum ether part；d.compound A fromRadix Angelicae dahuricae；e.Compound B fromRadix Angelicae dahuricae；1.verapamil；2.ethyl ether part；3.imperatorin；4.isoimperatorin

圖2 HPLC圖a.化合物A；b.化合物B；c.白芷的乙醇提取物；1.歐前胡素；2.異歐前胡素Fig.2 HPLC chromatogramsa.compound A；b.compound B；c.the same peak in 95%alcohol extract of Radix Angelicae dahuricae；1.imperatorin；2.isoimperatorin

3.3 歐前胡素和異歐前胡素對大鼠腹主動脈的作用 歐前胡素和異歐前胡素都能對重酒石酸去甲腎上腺素和氯化鈣誘導的濃度依賴性大鼠腹主動脈環(huán)收縮產(chǎn)生抑制作用。如圖5和圖6所示，用0.05，0.15和0.50μmol·L－1的歐前胡素，能夠使NE誘導的收縮強度從100%下降至78%±16%，48%± 5%和35%±4%，而使CaCl2誘導的收縮強度從100%分別下降至63%±2%，54%±3%和32%± 2%。此外，0.05，0.15和0.50μmol·L－1的異歐前胡素，能夠使重酒石酸去甲腎上腺素誘導的收縮強度從100%下降至83%±16%，66%±8%和53%± 13%，使氯化鈣誘導的收縮強度分別從100%下降至70%±10%，56%±5%和43%±4%，如圖7和圖8所示。pD2和pD2′是新藥或藥物作用研究中的常用手段。pD2是激動劑與受體親和力的定量表示。按照Ariens的定義，pD2是產(chǎn)生50%最大效應（E＝1／2Emax）的濃度的負對數(shù)（－lg［D］）。pD2值越大，說明藥物與受體的親和力越大，藥效越強。表1和表2中列出了歐前胡素和異歐前胡素在NE和CaCl2誘導下的pD2值。pD2′是用來表示非競爭性拮抗劑作用強度的參數(shù)。它越大，表示非競爭性拮抗劑作用越強，它的定義是在實驗系統(tǒng)中加入一定濃度（［D］2）的非競爭性拮抗劑，可以使激動劑在原來濃度2倍時產(chǎn)生原來濃度的效應水平，這種拮抗劑濃度的負對數(shù)（－lg［D］2）即pD2′。

圖3 a.歐前胡素的色譜掃描圖；b.歐前胡素的質譜圖；c.歐前胡素的結構式Fig.3 a.Scan chromatogram of imperatorin；b.Mass spectrogram of imperatorin；c.Structure of imperatorin

圖4 a.異歐前胡素的色譜掃描圖；b.異歐前胡素的質譜圖；c.異歐前胡素的結構式Fig.4 a.Scan chromatogram of isoimperatorin；b.Mass spectrogram of isoimperatorin；c.Structure of isoimperatorin

圖5 歐前胡素對NA誘導的大鼠動脈環(huán)收縮的抑制作用注：維拉帕米濃度：Cv＝0.08μmol·L－1；歐前胡素濃度：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1Fig.5 The inhibitory effects of imperatorin on the NA－induced contraction of rat abdominal aorta segmentsNote：verapamil concentration：Cv＝0.08μmol·L－1；imperatorin concentration：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1

圖6 歐前胡素對CaCl2誘導的大鼠動脈環(huán)收縮的抑制作用注：維拉帕米濃度：Cv＝0.08μmol·L－1；歐前胡素濃度：C1＝0.05，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1Fig.6 The inhibitory effects of imperatorin on the CaCl2－induced contraction of rat abdominal aorta segmentsNote：verapamil concentration：Cv＝0.08μmol·L－1；imperatorin concentration：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1

圖7 異歐前胡素對NA誘導的大鼠動脈環(huán)收縮的抑制作用注：維拉帕米濃度：Cv＝0.08μmol·L－1；異歐前胡素濃度：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1Fig.7 The inhibitory effects of isoimperatorin on the NA－induced contraction of rat abdominal aorta segmentsNote：verapamil concentration：Cv＝0.08μmol·L－1；isoimperatorin concentration：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1

圖8 異歐前胡素對CaCl2誘導的大鼠動脈環(huán)收縮的抑制作用注：維拉帕米濃度：Cv＝0.08μmol·L－1；異歐前胡素濃度：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1Fig.8 The inhibitory effects of isoimperatorin on the CaCl2－induced contraction of rat abdominal aorta segmentsNote：verapamil concentration：Cv＝0.08μmol·L－1；isoimperatorinconcentration：C1＝0.05μmol·L－1，C2＝0.15μmol·L－1，C3＝0.50μmol·L－1

每種化合物的pD2′值是用不同濃度的Emax值計算的。由表1和表2中的Emax值可得出，歐前胡素的收縮反應曲線以非平行方式向右偏移，pD2′值分別為6.28±0.15（NE誘導）和6.70±0.13（CaCl2誘導），對應的異歐前胡素的pD2′值為6.49±0.09（NE誘導）和6.91±0.07（CaCl2誘導）。異歐前胡素的血管舒張作用pD2′值明顯高于歐前胡素。

表1 歐前胡素對重酒石酸去甲腎上腺素和CaCl2誘導的大鼠動脈血管收縮的影響Tab.1 Effect of imperatorin on NE－and CaCl2－induced vasoconstriction strips of rat abdominal aorta segments （n＝8）

表2 異歐前胡素對重酒石酸去甲腎上腺素和CaCl2誘導的大鼠動脈血管收縮的影響Tab.2 Effect of isoimperatorin on NE－and CaCl2－induced vaso－constriction strips of rat abdominal aorta segments（n＝8）

4 討論

在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)大鼠動脈細胞膜色譜系統(tǒng)是非常有效的、能在混合藥物中（如中藥）篩選活性成分的方法。事實上，細胞膜色譜系統(tǒng)就像一個生物親和色譜柱，其中的大鼠動脈細胞膜固定相同時具有生物活性和層析分離的特性，能夠識別在混合物樣品中能與固定相發(fā)生作用的組分［20］。發(fā)生作用的組分能在細胞膜色譜系統(tǒng)上產(chǎn)生保留時間。通過這種方式，在使用柱色譜進行分離之前，能與細胞膜發(fā)生作用的靶標化合物很容易地就從混合物中被發(fā)現(xiàn)［21－22］。使用該系統(tǒng)，我們已經(jīng)證明作用于大鼠動脈細胞膜中的石油醚部分的成分能夠產(chǎn)生類似維拉帕米的功效。通過分離和鑒定，我們發(fā)現(xiàn)歐前胡素和異歐前胡素作為目標組分，其含量低于維拉帕米，如圖5～8所示。這些結果表明，歐前胡素和異歐前胡素對動脈細胞膜的生物親合性低于維拉帕米。

我們還發(fā)現(xiàn)，大鼠動脈細胞膜色譜系統(tǒng)中的篩選結果與體外藥理學實驗是密切相關的。從本次研究中所獲得的收縮反應數(shù)據(jù)表明，歐前胡素和異歐前胡素對NE和CaCl2誘導的血管舒張具有抑制作用，且該作用類似于對照藥維拉帕米——一種冠狀動脈或外周動脈的血管擴張劑。此外，所觀察到的藥效順序為：維拉帕米＞異歐前胡素＞歐前胡素，與其在大鼠動脈細胞膜色譜系統(tǒng)中得到的歐前胡素和異歐前胡素（表1～2中所示）的保留特性具有顯著的關聯(lián)。歐前胡素和異歐前胡素作為血管選擇性作用試劑的特性，像鈣拮抗劑一樣，是由血管擴張活動引起的。從這些研究中我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，中藥白芷治療臨床心血管疾病過程中，其所含的歐前胡素和異歐前胡素是其主要有效成分。因此，為了保持治療過程的有效性，白芷中歐前胡素和異歐前胡素的用量以及其處方應嚴格控制。

因此，這些結果為我們早期的結論——細胞膜色譜系統(tǒng)可以有效用于從復雜的混合物樣品中（如中國傳統(tǒng)中草藥）篩選活性成分提供了依據(jù)。CC，GC／MS和HPLC／MS技術可以用于各組分的分離和鑒定?；瘜W成分在特殊的組織或器官上的藥理作用，可以由其他體外功能性測試裝置進行測定，這是研究中藥有效成分的系統(tǒng)模式。

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Screening，analysis and effects of components fromRadix Angelicae dahuricae on rat artery

ZHANG Yu1，LI Ting1，YANG Jian2，ZHAO Jie1，HE Jianyu1＊，CHEN Qi3＊（1.School of Pharmacy，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China；2.Police Headquarters in Out patient Department，Beijing，100089，China；3.Department of Urology Surgery of the Second Affiliated Hospital，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710004，China）

Objective Effective components，imperatorin and isoimperatorin，fromRadix Angelicae dahuricae were screened and identified by using cell membrane chromatography（CMC）and gas chromatography／mass spectrometry（GC／MS）.Methods The components showed the effects of inhibiting vasoconstriction in vitro on rat abdominal aorta segments.The screening procedure was performed on a rat artery cell membrane column（50mm×1.0mm）with sodium phosphate buffer（pH 7.4）as the mobile phase under temperature of 37℃.Results The pharmacological results demonstrated that imperatorin and isoimperatorin can act on rat artery cell membrane as verapamil in CMC system.They can significantly inhibit the vasoconstrictions induced by norepinephrine bitartrate（NE）and the calcium chloride（CaCl2）.Conclusion Imperatorin and isoimperatorin are two main effective components of Radix Angelicae dahuricae as a medicine in the treatment for vessel disease.

Radix Angelicae dahuricae；imperatorin；isoimperatorin；cell membrane chromatography；inhibitory effect

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.011

R965

A

1004－2407（2015）01－0037－06

2014－07－29）

陜西省自然科學基金項目（編號：2011JM4035）

張宇，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：賀建宇，男，講師；陳琦，男，主治醫(yī)師