慶琳琳 胡繼春

北京市海淀醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100080

結(jié)直腸腺癌組織中c-JUN氨基末端激酶、E-選擇素、血管內(nèi)皮生長因子-D蛋白表達的臨床意義

慶琳琳 胡繼春

北京市海淀醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100080

目的探討c-JUN氨基末端激酶（c-JUN）、E-選擇素（E-selectin）、血管內(nèi)皮生長因子-D蛋白（VEGF-D）蛋白在結(jié)直腸腺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用。方法收集2012年8月～2014年9月于北京市海淀醫(yī)院手術(shù)切除的正常大腸黏膜組織標本（20例）和結(jié)直腸腺癌標本（50例），應用免疫組化法檢測標本中c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白的表達，觀察c-JUN、E-selectin、VEGF-D與臨床病理的聯(lián)系及c-JUN與E-selectin、VEGF-D的相關(guān)性。結(jié)果①結(jié)直腸癌組織中，c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白表達的陽性率（84%、78%、92%）顯著高于正常大腸黏膜組織（5%、10%、10%），差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；②c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白的表達與Dukes分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）；③c-JUN與E-selectin呈正相關(guān)（r=0.6394，P＜0.05），c-JUN與VEGF-D呈正相關(guān)（r=0.6592，P＜0.05）。結(jié)論E-selectin、VEGF-D蛋白與結(jié)直腸腺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，c-JUN可能調(diào)控E-selectin、VEGF-D的表達。

結(jié)直腸癌；c-JUN氨基末端激酶；E-選擇素；血管內(nèi)皮生長因子-D蛋白

結(jié)直腸腺癌是一種發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤，近年來發(fā)病率有增高的趨勢，其生長迅速與轉(zhuǎn)移的特性一直為研究者所關(guān)注，病理學改變最顯著的特征是新生血管及淋巴管生成，研究表明血管內(nèi)皮生長因子-D（vascular endothelial growth factor D，VEGF-D）在瘤體組織中高表達與以上病理改變可能有相關(guān)性［1-2］。另外，E-選擇素（E-selectin）同樣可以在某些腫瘤組織中有高表達，可能介導腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附，增加血管基底膜的通透性，進而導致腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［3］，但VEGF-D和E-selectin在結(jié)直腸腺癌組織中的同時表達是否與腫瘤生長與轉(zhuǎn)移有關(guān)則研究較少。近年來，腫瘤研究中基因調(diào)控的觀點逐漸被提出并證明，即腫瘤的發(fā)生與進展都由某些信號傳導通路所控制，而在這些通路中的關(guān)鍵蛋白因子可能是影響腫瘤形成與轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵位點。在結(jié)直腸腺癌中，參與機體中多種重要免疫反應的c-JUN氨基末端激酶（c-JUN NH2-terminal kinase，c-JUN）是否對E-selectin和VEGF-D的表達有調(diào)控作用也是需要研究的關(guān)鍵點?；谝陨涎芯勘尘?，本研究收集并檢測結(jié)直腸腺癌組織中c-JUN、VEGF-D、E-selectin蛋白的表達并探討與病理特征的相關(guān)性，分析臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年8月～2014年9月于北京市海淀醫(yī)院普通外科手術(shù)切除的50例結(jié)直腸癌組織和20例正常大腸組織（非結(jié)直腸癌）。結(jié)直腸癌患者50例中，男37例，女13例；年齡37～78歲；結(jié)直腸癌Dukes分期：A期5例，B期17例，C期20例，D期8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例；術(shù)前均未接受放、化療及免疫治療，術(shù)后均經(jīng)病理檢查證實。非結(jié)直腸癌患者20例中，男14例，女6例，年齡30～72歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白檢測

試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)公司，所有組織均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm厚病理切片，貼附于多聚賴氨酸的載玻片上。采用免疫組化SP法檢測，一抗均為鼠抗人單克隆抗體，DAB顯色，全部操作過程均按試劑說明書進行，用已知陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液（PBS）替代一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定標準[4]

采用雙人雙盲法判定，免疫組化陽性初步判定標準為細胞核或細胞核與細胞質(zhì)中同時出現(xiàn)棕黃色顆粒，①陽性細胞百分比評定標準：隨機選取4個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞的百分比，0分為陽性細胞數(shù)百分比為0，1分為陽性細胞數(shù)≤10%，2分為10%＜陽性細胞數(shù)百分比≤50%，3分為50%＜陽性細胞數(shù)≤75%，4分為陽性細胞數(shù)＞75%。②染色強度評分標準：0分為無顯色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。免疫組化最終結(jié)果判定標準：陽性細胞百分比與染色強度評分的乘積＜3為免疫組化結(jié)果陰性，≥3為免疫組化結(jié)果陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 12.00對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗；相關(guān)性分析應用Spearman相關(guān)分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白表達

c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達的陽性率明顯高于正常結(jié)直腸黏膜表達率，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 c-JUN、E-selestion、VEGF-D蛋白在結(jié)直腸正常黏膜和結(jié)直腸腺癌組織中陽性表達情況［n（%）］

2.2 c-JUN與E-selectin、VEGF-D在結(jié)直腸癌中的表達與病理特征的關(guān)系

c-JUN與E-selectin、VEGF-D陽性表達率與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位無關(guān)（P＞0.05），與Duckes分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 c-JUN、E-selection、VEGF-D蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達與病理特征的關(guān)系［n（%）］

2.3 c-JUN與E-selectin、VEGF-D相關(guān)性

c-JUN與E-selectin呈正相關(guān)（r=0.6394，P＜0.05），c-JUN與VEGF-D呈正相關(guān)（r=0.6592，P＜0.05）。

3 討論

結(jié)直腸腺癌作為一種發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤，已經(jīng)被基礎與臨床研究工作者所關(guān)注，從病理特征上觀察，其具有其他惡性腫瘤的共同特點：瘤體失控性迅速生長，并發(fā)生原發(fā)腫瘤部位以外的遠端轉(zhuǎn)移。對于惡性腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，雖然其確切的機制未完全闡明，但大量病理研究結(jié)果表明：腫瘤組織內(nèi)可見新生血管及淋巴管大量形成，這些新生血管一方面可以為腫瘤細胞的生長提供營養(yǎng)支持，另一方面可能為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移提供條件。所以，腫瘤組織內(nèi)新生血管與淋巴管的大量增生是腫瘤生長與發(fā)展的必要條件，研究分析這些病理改變的相關(guān)因素可能為進一步了解腫瘤的發(fā)病機制提供新的途徑。

在正常生理情況下，機體內(nèi)存在一個“精密”的調(diào)控體系，對于一般性損傷所需要的修復可以通過一些“免疫因子”來完成，VEGF是一類能促進血管內(nèi)皮生長的免疫因子，可以由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生釋放，促進血管形成及生長［5］，在正常生理條件下，VEGF表達較少，但在病理條件下，在某些惡性腫瘤組織中可以檢測到其高表達，已有研究報道在乳腺癌、肝癌、大腸癌等腫瘤疾患中VEGF有高表達［6-8］。VEGF-D是VEGF的一個亞型，與VEGF-C有近50%的基因同源性，據(jù)研究主要作用是促進新生血管生長，并且可以增加血管內(nèi)皮細胞的通透性。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)［9］，在胃腸道腫瘤疾患中，VEGF-D在腫瘤組織內(nèi)特異性染色檢查顯示有高表達，表明可能有促進腫瘤組織中新生血管形成的作用，即VEGF-D對腫瘤的生長有促進作用。所以，最新的觀點認為VEGF-D是一種較強的腫瘤生長刺激因子。本研究觀察也驗證了這一觀點：在結(jié)直腸腺癌中，VEGF-D表達增高，并隨腫瘤的病理分期進展而持續(xù)增加，同時在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中有較高表達，提示其與結(jié)直腸癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

惡性腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤特征的另一大表現(xiàn)，據(jù)研究，惡性腫瘤細胞可以浸潤性生長并突破血管的基底膜進入血液循環(huán)發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移，其相關(guān)作用機制較為復雜，可能有多種相關(guān)免疫蛋白參與，經(jīng)過多年研究，現(xiàn)在一致的觀點認為：首先，是惡性腫瘤細胞自身會發(fā)生變異，逃避機體免疫免疫系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與清除；其次，某些活性免疫蛋白分子可以在瘤體局部活性增高，誘使腫瘤細胞較易發(fā)生局部位移，突破血管基底膜進入血液循環(huán)，最終發(fā)生距離較遠的遷移與種植［10］。E-selectin是一種免疫因子，屬于選擇素家族中的一個重要成員，可以由血管內(nèi)皮細胞分泌，作用為促進炎性反應細胞（中性粒細胞、巨噬細胞等）與血管內(nèi)皮細胞發(fā)生黏附，為炎性細胞到達炎癥部位發(fā)揮作用而創(chuàng)造條件［11］。在某些腫瘤疾患中，E-selectin的高表達與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移可能存在密切的聯(lián)系，如胃癌患者腫瘤組織內(nèi)和血清中都可以檢測到E-se lectin分泌水平高于正常健康人，并與腫瘤分級和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［12］。本研究結(jié)果也可以觀察到E-selectin在腫瘤組織內(nèi)的表達增高，與VEGF-D一樣，隨腫瘤病理分期加深和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而進一步增加。

近年來，在腫瘤相關(guān)研究中，基因調(diào)控的觀點備受關(guān)注，即許多免疫蛋白的表達都可能有一個或幾個信號傳導途徑參與調(diào)控，在這些途徑上的關(guān)鍵調(diào)控因子則成了研究的熱點［13］。C-JUN是機體內(nèi)一個重要的調(diào)控通路的位點，屬于有絲分裂原活化蛋白激酶（Mitogen actived protein kinase，MAPK）的一個重要的細胞內(nèi)信號傳到通路，與細胞的代謝、生長、增殖有關(guān)［14］。有研究表明［15-16］：腫瘤組織內(nèi)免疫組化檢測可見c-JUN蛋白呈強染色表達，提示腫瘤細胞增生分化可能有c-JUN蛋白信號傳導通路參與，但具體作用機制未完全闡明。在本研究中也可以觀察到c-JUN的表達增高，統(tǒng)計學分析顯示c-JUN與VEGF-D和E-selectin的表達均有正相關(guān)性，此結(jié)果提示c-JUN蛋白可能是VEGF-D和E-selectin蛋白分泌的一個上位調(diào)控位點，c-JUN增高，促進VEGF-D和E-selectin的相應增高，提示c-JUN對VEGF-D和E-selectin有調(diào)控作用。c-JUN是上位控制蛋白，而VEGF-D和E-selectin是下位“靶蛋白”，在正常情況下，應該存在負反饋調(diào)節(jié)，但腫瘤疾患中，原有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)會出現(xiàn)紊亂，可能出現(xiàn)與正常調(diào)節(jié)相反的正反饋調(diào)節(jié)，促進腫瘤的生長。依據(jù)以上推論，假設如果能控制腫瘤組織中c-JUN的高表達，是否可以控制VEGF-D和E-selectin的過量分泌，但從現(xiàn)今的研究進展看，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多種免疫蛋白參與的復雜過程，更加復雜的是多種免疫蛋白還存在相互作用的網(wǎng)絡性［17-18］，c-JUN信號傳導通路可能并非是結(jié)直腸癌中唯一的信號傳導調(diào)控通路，隨著分子生物學的研究進展勢必有更多的信號傳導通路會被發(fā)現(xiàn)，所以現(xiàn)在的研究結(jié)果并非能全面闡述腫瘤的發(fā)生與演變，特別是僅幾個免疫蛋白的表達變化并不能完全反映機體整體的免疫變化，還需要大量的研究提供重要的線索來充分闡明腫瘤發(fā)生與發(fā)展的確切作用機制，為將來更多的有效治療提供新的依據(jù)。

本研究對結(jié)直腸癌組織中VEGF-D和E-selectin的表達進行檢測，結(jié)果提示兩者表達的共同增加是一個明顯的特征性改變，VEGF-D可以促進血管及淋巴管不斷增生，瘤體血運豐富，腫瘤細胞生長活躍，但腫瘤細胞僅在局部生長而不能移動，則不會發(fā)生轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移必然需要其他免疫因子的幫助，E-selectin可能起到了關(guān)鍵作用，其在腫瘤組織內(nèi)部大量表達，推測可能促進了腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞或淋巴管內(nèi)皮細胞的黏附，一旦突破了基底膜，腫瘤細胞便會發(fā)生轉(zhuǎn)移。兩者之間還可能存在協(xié)同促進作用，但具體機制還需要更加深入的研究。

綜上所述，VEGF-D和E-selectin與結(jié)直腸癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移有關(guān)，c-JUN可能調(diào)控VEGF-D和E-selectin的表達。但由于本研究結(jié)果還有很大的局限性，更確切的機制還需要進一步的研究。

［1］Darting TE，Zhong M，Vo BH，et al.Vascular endothelial growth factor A，secreted in response to transforming growth factor-betal under hypoxic conditions，induces autocrine effects on migration of prostate cancer cells［J］. Asian J Androl，2012，14（5）：745-751.

［2］鄒永祎，王智剛，張克新，等.肺癌患者血清畸胎瘤衍生生長因子、VEGF和TK1水平及臨床意義［J］.臨床檢驗雜志，2014，32（6）：414-417.

［3］魯建軍，馬俊，繆蓉，等.血管內(nèi)皮生長因子D在食管鱗癌組織中的表達及其臨床意義［J］.中華胃腸外科雜志，2013，16（12）：1191-1194.

［4］王洪遠，費洪鈞，梁雅靜.食管癌組織中上皮鈣黏素、CD44v6和血管內(nèi)皮生長因子C表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系［J］.腫瘤研究與臨床，2010，11（22）：755-757.

［5］周紅鳳，付冬偉，胡曉薇，等.胃癌組織中的MUC1和VEGF表達及其意義［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2014，25（5）：4950-4953.

［6］Hua J，Spee C，Kuse S，et al.Recombinant human VEGF165b inhibitsexperimentalchoroidalneovascularisation［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51（8）：4282-4288.

［7］付東梅，李立方，康玉華，等.人胃癌組織中巨噬細胞移動抑制因子和VEGF的表達及其臨床意義［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2014，21（4）：455-458.

［8］Fu Y，Lai Y，Wang Q，et al.Over expression of VEGF sterin promotes angiogenesis via the vascular endothelial growth factor in primary ovarian cancer［J］.Mol Med Rep，2013，7（6）：1726-1732.

［9］MylonaE，AlexandrouP，MpakaliA，etal.Clinicopathological and prognostic significance of vascular endothelial growth factors（VEGF）-C and-D and VEGF receptor 3 in invasive breast carcinoma［J］.Eur J Surg Oncol，2007，33：294-300.

［10］Kaneko I，Tanaka S，Oka S，et al.Lymphatic vessel density at the site of deepest penetration as a predictor of lymph node metastasis in submucosal colorectal cancer［J］.Dis Colon Rectum，2007，50：13-21.

［11］李叢叢，楊錫貴，姜超，等.E-選擇素在食管鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義［J］.腫瘤防治研究，2013，11（40）：1050-1053.

［12］張勇超.胃癌患者血清可溶性E-選擇素檢測的臨床意義［J］.中國腫瘤臨床，2010，7（37）：402-404.

［13］Kim SH，Kim SH，Kim YB，et al.Genistein inhibits cell growth by modulating various mitogen activated protein kinases and AKT in cervical cancer cells［J］.Ann N Y Acad Sci，2009，1171：495-500.

［14］Wu Y，Chen Y，Qu R，et al.TypeⅡGMP dependent protein kinase inhibits EGF-triggered signal transduction of the MAPK/ERK-mediated pathway in gastric cancer cells［J］. Oncol Rep，2012，27（2）：553-558.

［15］桑建榮，陳永昌，李月英.PKGⅡ?qū)ξ赴㏒GC-7901細胞增殖相關(guān)的MAPK/ERK下游信號分子的抑制作用［J］.腫瘤，2012，32（11）：862-867.

［16］Shaker OG，Deen MA，Rahim MT，et al.Gene expression of E-selectin in tissue and its protein level in serum of breast cancer patients［J］.Tumori，2006，92（6）：524-530.

［17］Pandey V，Kumar V.HBx protein of hepatitis B virus promotes reinitiation of DNA replication by regulating expression and intracellular stability of replication licensing factor CDC6［J］.J Biol Chem，2012，287：20545-20554.

［18］Pan YZ，Morris ME，Yu AM，et al.MicroRNA-328 negatively regulates theexpression of breast cancer resistance protein（BCRP/ABCG2）in humancancer cells［J］.Mol Pharmacol，2009，75（6）：1374-1379.

Clicinal significance of expression of c-JUN,E-selectin,VEGF-D protein in colorectal carcinoma

QING LinlinHU Jichun
Department of Gastroenterology,Beijing Haidian Hospital,Beijing100080,China

ObjectiveTo investigate the role of c-JUN,E-selectin,VEGF-D protein in the development and metastasis of colorectal carcinoma.MethodsFrom August 2012 to September 2014,20 normal tissues and 50 colorectal carainomas samples from surgical resection in Beijing Haidian Hospital were selected.The expression of c-JUN,E-selectin,VEGF-D protein in these samples were detected by immunohistochemistry,the relationship of c-JUN,E-selectin,VEGF-D with clinical pathologh was observed,and the correlation of c-JUN with E-selectin and VEGF-D was analyzed.Results①The positive rate of c-JUN,E-selectin,VEGF-D protein(84%,78%,92%)in colorectal tumor tissues were significantly higher than those in normal tissues(5%,10%,10%),the differences were statistically significant(P＜0.01).②The positive rates of c-JUN,E-selectin,VEGF-D protein were associated with Dukes stage and lymph node metastasis(P＜0.05).③A significant positive relation was observed between the positive rate of c-JUN and E-selectin(r=0.6394,P＜0.05),and a significant positive relation was observed between the positive rate of c-JUN and VEGF-D(r=0.6592,P＜0.05).ConclusionThe expression of c-JUN,E-selectin,VEGF-D protein may be involved in the development and metastasis.The expression of E-selectin and VEGF-D may be regulated by c-JUN protein.

Colorectal carcinoma;c-JUN;E-selectin;VEGF-D

R737.24

A

1673-7210（2015)02（b)-0095-04

2014-11-08本文編輯：蘇暢）