馬興璇 孫一帆 生淑亭 韋麗麗 劉春明 張紅雨 吳玉芬 王林春 龍康

1.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院檢驗科，廣西柳州545001；2.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院婦科，廣西柳州545001；3.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院中心實驗室，廣西柳州545001

免疫性不孕癥患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4的水平研究

馬興璇1孫一帆1生淑亭2韋麗麗2劉春明1張紅雨1吳玉芬3王林春1龍康1

1.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院檢驗科，廣西柳州545001；2.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院婦科，廣西柳州545001；3.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院中心實驗室，廣西柳州545001

目的探討外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（CD4+CD25+Treg）、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）與免疫性不孕的關(guān)系，為免疫性不孕的診斷和治療提供依據(jù)。方法用流式細胞儀檢測60例免疫性不孕婦女（研究組）和60例正常妊娠的育齡婦女（對照組）外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平，并對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果研究組外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平值分別為：（3.66±0.59）%、（2.97±0.63）%、（3.17±0.36）%，均低于對照組［（8.17±0.63）%、（7.17±0.53）%、（8.21±0.56）%］，兩組比較差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。結(jié)論免疫性不孕癥患者外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4的表達水平比正常妊娠的育齡婦女少，CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表達的降低可能是免疫性不孕的重要原因。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞；免疫性不孕；細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4；叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3

目前免疫性不孕的診斷標準是：夫婦雙方同居一年以上，其他檢查結(jié)果均正常，而由女方血清抗精子抗體（ASAb）和（或）抗卵透明帶抗體（ZPAb）陽性引起的不孕［1］，它是婦科的常見病之一。據(jù)統(tǒng)計，已婚婦女中約20%患有不孕癥，其中20%～40%屬于免疫性不孕，由于多種因素的影響，近年來發(fā)病率有上升的趨勢［2-3］。但長期以來免疫性不孕的病因不明確，特別是分子和細胞水平的研究幾乎空白，評價診斷和治療效果缺乏量化的指標。研究表明，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（CD4+CD25+Treg）與免疫性疾病密切相關(guān)，其數(shù)量和功能異常是免疫性疾病的病因之一。為了探明外周血中CD4+CD25+Treg與免疫性不孕的關(guān)系，筆者對60例免疫性不孕婦女外周血中的CD4+CD25+Treg、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）進行了對照研究，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 標本來源

研究組：收集2014年6～10月在廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院（以下簡稱“我院”）婦科門診就診并經(jīng)過檢查確診的免疫性不孕婦女60例，年齡24～41歲，平均（32±6）歲。對照組：收集2014年6～9月在我院婦科門診做人工流產(chǎn)術(shù)的健康育齡婦女60例，年齡16～43歲，平均（28±7）歲。研究組和對照組平均年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器

1.2.1.1 主要試劑藻紅蛋白（PE）結(jié)合的CD4-PE單抗和異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD25-FITC單抗、PE藻青蛋白標記（APC）標記的鼠抗人CTLA-4抗體、APC Foxp3單抗及配套染色試劑均購自美國BD公司。

1.2.1.2 儀器美國BD公司生產(chǎn)的FACS Calibur型流式細胞儀。

1.2.2 檢測方法

清晨空腹采集2 mL靜脈血，EDTA-2K抗凝，以淋巴細胞分離液獲得單個核細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞懸液濃度為1×107/mL，取樣100 μL，分別加入10 μL CD4、CD25、CTLA-4、Foxp3抗體，室溫下避光10 min，加溶血素2 mL后再避光15 min，根據(jù)紅細胞的裂解狀態(tài)，以1500 r/min離心5 min，棄去上清液，加磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌1次，再加300 μL PBS液混勻，上流式細胞儀進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

研究組外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平均低于對照組，兩組比較差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平比較

表1 兩組外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平比較

注：CD4+CD25+Treg：CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞；Foxp3：叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3；CTLA-4：細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4

組別CD4+CD25+TregFoxp3CTLA-4研究組對照組t值P值3.66±0.59 8.17±0.63 3.82＜0.01 2.97±0.63 7.17±0.53 3.63＜0.01 3.17±0.36 8.21±0.56 3.46＜0.01

3 討論

與免疫性不孕相關(guān)的免疫性抗體的研究報道很多，包括ASAb、ZPAb、抗子宮內(nèi)膜抗體（EmAb）、抗心磷脂抗體（AcAb）、抗卵巢抗體（AoAb）等，但目前只有ASAb、ZPAb已通過動物實驗得到證實［4］。ASAb可從多個環(huán)節(jié)影響不孕［5-9］：①干擾精子獲能、頂體反應(yīng)及受孕：宮頸黏液中含有抗凝血酶和蛋白酶抑制劑，可抑制精子頂體酶系的活性，影響精子獲得能量。表面帶的免疫球蛋白的精子，在通過宮頸黏液時，可與黏液中受體片段結(jié)合，發(fā)揮作用，從而阻礙精卵結(jié)合。②清除女性生殖道精子：通過補體介導，ASAb激活巨噬細胞發(fā)揮對精子的吞噬作用，加速清除女性生殖道內(nèi)精子，降低精子密度，影響受精。透明帶（ZP）Ab可通過以下機制導致不孕［10-14］：由于ZPAb結(jié)合在ZP上，即使卵子與精子能夠結(jié)合成為受精卵，受精卵也會受到一定的損傷，因此導致不孕；由于ZPAb能與ZP結(jié)合，干擾不透明帶上的精子受體，使卵子與精子不能相互發(fā)現(xiàn)而結(jié)合成為受精卵；由于卵巢的損傷，使卵巢分泌與妊娠相關(guān)的激素減少，導致子宮內(nèi)膜分泌女性激素不足或分泌減少，造成不孕；由于卵巢的在ZPAb的作用下，容易發(fā)生炎癥等，使卵泡發(fā)育不是很好或者導致排卵困難或不能排卵。同時ASAb和（或）ZPAb的檢測結(jié)果只能定性，不能定量，并且檢測的結(jié)果影響因素很多，特異性低，很多婦科疾病都會引起ASAb和（或）ZPAb陽性，所以針對免疫性不孕的診斷和治療亟需尋找一個可以量化的指標。

CD4+CD25+Treg是重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，CD4+CD25+Treg的功能特點［15］：①CD4+CD25+Treg在體內(nèi)主要作用是發(fā)揮免疫自穩(wěn)功能，去除或減少血液中CD4+CD25+Treg，則可引發(fā)多種自身免疫性疾病，而輸入CD4+CD25+Treg則可抑制多種自身免疫性疾病發(fā)生。②CD4+CD25+Treg不但可以在胸腺內(nèi)生成，在外周也可以產(chǎn)生。如果CD4+CD25+Treg在血液中的比例或功能發(fā)生改變，容易引起多種與免疫有關(guān)的疾病。

CD4+CD25+Treg的表型標記主要包括CTLA-4和Foxp3等。CTLA-4的主要作用是CD4+CD25+Treg在被激活后，CTLA-4可從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)而組成性表達在細胞表面，細胞表面的CTLA-4分子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Foxp3的主要作用是它的表達可使CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞分化為CD4+CD25+Treg，并發(fā)揮免疫抑制作用。但是Foxp3對CD4+CD25+Treg的調(diào)節(jié)機制還不清楚，有待于進一步研究。由于CTLA-4和Foxp3都能在CD4+CD25+Treg上表達，所以可以通過檢測T淋巴細胞中的CTLA-4和（或）Foxp3的比例和功能，從而間接了解CD4+CD25+Treg在T淋巴細胞中的比例和功能。

國內(nèi)外很多學者通過研究發(fā)現(xiàn)：人類妊娠蛻膜中含大量的CD4+CD25+Treg。CD4+CD25+Treg有可能在人類妊娠的過程中發(fā)揮了重要作用，它在T淋巴細胞中的功能和數(shù)量的失調(diào)可能將影響妊娠的結(jié)局。通過動態(tài)跟蹤檢測發(fā)現(xiàn)，在整個妊娠的過程中CD4+CD25+Treg的比例在逐漸增高，從早期妊娠到足月時蛻膜中CD4+CD25+Treg占CD4+T細胞的9%～15%。根據(jù)這些細胞的特征，這些被確認的T細胞在人類蛻膜中顯示出CD4+CD25+Treg的表型［16-18］。這些高表達的表型包括CTLA-4、糖皮質(zhì)激素誘導的腫瘤壞死因子以及Foxp3等［19］。同時研究還發(fā)現(xiàn)：CD4+CD25+Treg在早期妊娠婦女外周血中升高，至中期妊娠達到最高峰，而產(chǎn)后數(shù)量下降，所以妊娠期間CD4+CD25+Treg是動態(tài)變化的［20-21］，提示妊娠時全身CD4+CD25+Treg存在系統(tǒng)擴增，并且還證實CD4+CD25+Treg的擴增不是被同種抗原驅(qū)使的，而是被妊娠本身驅(qū)使的。妊娠時CD4+CD25+Treg絕對數(shù)量的增加預(yù)示其更強的免疫耐受環(huán)境，這是母胎耐受所需。Aluihare等［20］研究顯示調(diào)節(jié)性T細胞募集或功能可能在不孕癥中受到損害，不孕癥可能與免疫耐受的受損相關(guān)。

筆者通過研究發(fā)現(xiàn)：研究組外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4數(shù)量與對照組比較差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），免疫性不孕患者外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表達明顯低于能正常妊娠的育齡婦女。CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表達降低可能是免疫性不孕的病因之一，通過免疫抑制劑治療，提高患者體內(nèi)的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表達可能是治療免疫性不孕的重要手段。但CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4在免疫性不孕中如何發(fā)揮作用，它的調(diào)節(jié)機制仍有待于進一步研究。

［1］計家平，張狄，程涇.免疫性不孕癥的病因病機與中醫(yī)治療近況［J］.中醫(yī)藥信息，2011，27（5）：115.

［2］王成宇.抗精子免疫性不孕與生殖道炎癥的相關(guān)性研究［J］.中國保健營養(yǎng)，2013，4（上）：1647.

［3］劉茜，武松，王望九，等.昆明種小鼠H2-Eb位點多態(tài)性與免疫性不孕不育的相關(guān)性研究［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2012，47（2）：132.

［4］張敏.抗透明帶抗體抗精子抗體與不孕及反復(fù)自然流產(chǎn)的研究［J］.井岡山醫(yī)專學報，2008，15（4）：10-11.

［5］孫莉，武軍駐.抗精子抗體引起不孕不育的機制研究［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2012，11（1）：109-110.

［6］劉卓，周英惠.免疫不孕癥的病因病機與治療近況［J］.山西中醫(yī)學院學報，2010，9（1）：53-55.

［7］林晶.抗精子抗體檢測對不孕不育的診斷意義［J］.中國當代醫(yī)藥，2009，16（4）：54.

［8］王錚，仇東輝，黃國香，等.不孕不育婦女自身免疫抗體的研究［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2008，（16）：10.

［9］蔡群英，王繼榮.不孕癥原因臨床調(diào)查［J］.齊魯醫(yī)學檢驗，2013，14（3）：65.

［10］付莉，馮衛(wèi)，趙怡璇，等.卵巢早衰和不孕癥患者血清中抗透明帶抗體和Th1/Th2細胞因子的測定及意義［J］.中國婦幼保健，2009，24（17）：2413.

［11］張曉勇，趙可寧，夏桂成.抗透明帶抗體的中醫(yī)研究綜述［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2012，21（1）：60-62.

［12］Li J，Jin H，Zhang A，et al.Enhanced contracep tive response by coimmuniza tion of DNA and protein vaccines encoding the mouse zona pellucida 3 with minimal oophoritis in mouse ovary［J］.J Gene Med，2009，9（12）：1095.

［13］Hardy CM，Beaton S，Hinds LA.Immunocon tracep tion in mice using repeated，multi-antigen peptides：immunization with purified recombinant antigens［J］.Mol Reprod Dev，2008，75（1）：126.

［14］叢羽.不孕不育婦女7項自身免疫抗體的檢測研究［J］.長春中醫(yī)藥大學學報，2010，23（5）：82.

［15］吳銀亞.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞在慢性乙型肝炎發(fā)病機制中的作用［J］.中華傳染病雜志，2013，13（4）：205-206.

［16］湛潔誼，盧慧敏，林穗玲，等.哮喘患兒外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的測定及臨床意義［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014，52（25）：10-12.

［17］邢超，郭文堅，謝奇朋，等.外周血細胞淋巴亞群檢測對噬血細胞綜合征患者免疫功能評估的意義［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2012，50（28）：30-31.

［18］梁永任，黃燕金，梁日光，等.腹腔鏡手術(shù)對膽結(jié)石患者免疫球蛋白、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的影響機制研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2012，50（18）：50-52.

［19］Dieckmann D，Bruett CH，Ploettner H，et al.Human CD4+CD25+regulatory，contact-dependent T cells induce interlonkin 10-producing，contact-independent type 1-like regulatory T cells［J］.J Exp Med，2012，196（2）：247-253.

［20］Aluvihare VR，Kallikourdis M，Betz AG.Regulatory T cells mediate matemal tolerance to the fetus［J］.Nal Immonol，2011，5（3）：266-271.

［21］Jin LP，Zhou YH，Wang MY，et al.Blockade of CD80 and CD86 at the time of implantation inhibits maternal rejection to the allogeneic fetus in abortion prone matings［J］.J Reprod Immunol，2012，65（2）：133-146.

Research on relationship between frequency of circulating CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 and immunological infertility

MA Xingxuan1SUN Yifan1SHENG Shuting2WEI Lili2LIU Chunming1ZHANG Hongyu1WU Yufen3WANG Linchun1LONG Kang1
1.Department of Chinical Laboratory,the Hospital of Traditional Chinese Medicinal of Liuzhou City,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Liuzhou545001,China;2.Department of Gynaecology,the Hospital of Traditional Chinese Medicinal of Liuzhou City,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Liuzhou545001,China;3.Department of Central Laboratory,the Hospital of Traditional Chinese Medicinal of Liuzhou City,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Liuzhou545001,China

ObjectiveTo investigate the relationship between the frequency of circulating CD4+CD25+Treg,Foxp3, CTLA-4 and immunological infertility,and to provide the basis for the diagnosis and treatment of immunological infertility.MethodsThe levels of the circulating CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 were detected by flow cytometry(FCM) in 60 cases of immunological infertility women(study group)and 60 cases of health gestation age women(control group), and the results were analyzed with statistics.ResultsThe levels of the CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 in peripheral blood of the study group were(3.66±0.59)%,(2.97±0.63)%,(3.17±0.36)%,which were lower than those of the control group［(8.17±0.63)%,(7.17±0.53)%,(8.21±0.56)%］,the differences between the two groups had statistical significances (allP＜0.01).ConclusionThe levels of the CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 in immunological infertility women have significantly decreased,which suggestes that the reduce of the gestation CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 may play an important role in female immunological infertility.

CD4+CD25+regulatory T cells;Immunological infertility;Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4;Foxp3

R714.21

A

1673-7210（2015）02（a）-0088-04

2014-11-10本文編輯：衛(wèi)軻）

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題（編號Z2014443）。