楊麗君 崔紅

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院兒科，北京100050

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1在缺氧后腦損傷中的表達(dá)模式

楊麗君 崔紅

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院兒科，北京100050

目的通過了解細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1（ERK-1）在缺氧腦損傷大鼠腦中的表達(dá)，了解其參與缺氧腦損傷的過程。方法48只3 d齡新生SD大鼠，隨機(jī)分成2組：對照組和缺氧組，每組各24只，缺氧組SD大鼠置于自制密閉容器中，充以含8%氧氣的氧氮混合氣體，時(shí)間為90 min，對照組SD大鼠不進(jìn)行處理。分別于造模后6個(gè)時(shí)間點(diǎn)——1、3、7、14、21 d和28 d后留取兩組SD大鼠腦組織，采用Western blot檢測ERK-1總蛋白在腦組織中的表達(dá)情況。結(jié)果缺氧組大鼠腦組織ERK-1呈現(xiàn)動態(tài)表達(dá)；變化規(guī)律：在缺氧早期（缺氧后1～7 d），ERK-1總蛋白的表達(dá)均有降低的趨勢，缺氧后第14天開始其表達(dá)具有升高的趨勢，缺氧后第21天和第28天ERK-1表達(dá)量又有所下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論缺氧造成新生大鼠腦損傷時(shí)，ERK-1總蛋白的表達(dá)譜沒有明顯變化的趨勢，提示在早產(chǎn)兒缺氧性腦損傷時(shí)ERK-1并不通過劑量的變化對缺氧后腦組織損傷進(jìn)行調(diào)節(jié)。

早產(chǎn)兒；缺氧性腦損傷；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1；大鼠

早產(chǎn)兒的存活率和生命質(zhì)量的改善是本世紀(jì)新生兒醫(yī)學(xué)重點(diǎn)攻克的目標(biāo)之一。據(jù)WHO報(bào)道，全球每年有1500萬早產(chǎn)兒出生，且早產(chǎn)兒的發(fā)生率在逐年上升，我國人口眾多，每年出生的早產(chǎn)兒缺氧缺血性腦損傷的發(fā)病數(shù)目更為驚人，在早產(chǎn)兒中常常會發(fā)生學(xué)習(xí)困難，表現(xiàn)為閱讀、拼寫、計(jì)算或?qū)懽骼щy。雖然近年來早產(chǎn)兒的預(yù)后有了很大的改善，但早產(chǎn)兒腦損傷所帶來的后遺癥等仍然是影響早產(chǎn)兒最終生命質(zhì)量的嚴(yán)重問題。迄今為止，早產(chǎn)兒腦損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于包括哺乳動物在內(nèi)的多種生物細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1（extracellular signal regulated protein kinase 1，ERK-1）是所有絲裂原活化蛋白激酶家族最早被認(rèn)識的成員，有文獻(xiàn)報(bào)道，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的重要細(xì)胞信號通路［1］，近期有文獻(xiàn)報(bào)道，硫氫化鈉誘導(dǎo)的增殖也與ERK-1的磷酸化有關(guān)［2］。同時(shí)，ERK-1與凋亡也有比較密切的關(guān)系，有研究報(bào)道，其在腦缺血再灌注損傷發(fā)生過程發(fā)揮著重要作用［3-4］。近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道，其在缺氧/復(fù)氧損傷發(fā)生過程中也發(fā)揮非常重要的作用［5］。Liu等［6］研究發(fā)現(xiàn)缺氧也能夠激活腎側(cè)群細(xì)胞的ERK的活性，但是在非側(cè)群細(xì)胞則不出現(xiàn)這種現(xiàn)象。近來有研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性因素刺激下，ERK-1參與了血腦屏障的Na+/H+交換以及Na+-K+-Cl-共運(yùn)輸?shù)倪^程［7］。也有研究認(rèn)為缺氧能夠在體外上調(diào)ERK-1的磷酸化［8］，但是ERK-1在缺氧性腦損傷發(fā)生之后的動態(tài)表達(dá)譜尚不明確，本研究擬在缺氧發(fā)生后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行ERK-1的表達(dá)檢測，從而明確ERK-1在缺氧發(fā)生后的表達(dá)情況，從而更加有助于探討缺氧性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展以及神經(jīng)修復(fù)過程。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中用到的3 d齡SD大鼠（SPF級，雌雄不計(jì)，體重8～10 g）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2007-0001］，充入的氮氧混合氣體（8%O2+92%N2）由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院（以下簡稱“我院”）提供，本實(shí)驗(yàn)室自制封閉容器。

1.2 缺氧模型的建立

實(shí)驗(yàn)所用到的3 d齡SPF級SD大鼠，日常在我院SPF級動物房飼養(yǎng)，條件如下，照明時(shí)間；黑暗時(shí)間=12 h∶12 h，溫度：23～25℃，濕度保持在40%。將乳鼠隨機(jī)分為兩組：對照組和缺氧組，每組各24只，對照組不做處理，缺氧組放入本實(shí)驗(yàn)室自制容器，在37℃水浴中充以氮氧混合氣（O2占8%），持續(xù)時(shí)間為90 min，之后回籠，繼續(xù)行母乳喂養(yǎng)。

1.3 大鼠腦組織標(biāo)本獲取

分別于缺氧模型建立后第1、3、7、14、21天和第28天6個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死兩組大鼠，其中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對照組和缺氧組大鼠各4只，每組大鼠的左側(cè)腦組織立即放入10%的中性福爾馬林溶液固定，之后進(jìn)行切片、備用，右側(cè)大腦立即放入液氮保存，用于進(jìn)行Western blot檢測。

1.4 HE染色

將腦組織用10%的中性福爾馬林液中固定8 h，依次放入20%、30%蔗糖溶液分別過夜（24～48 h）沉底，組織沉底之后即可進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為12 μm，進(jìn)行HE染色，參見既往發(fā)表文章［9］，拍照保存。

1.5 Western blot檢測ERK-1表達(dá)量

預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑Protease inhibitor cocktail（Roche）。按組織重量9倍比例加入裂解液，冰上用組織勻漿器進(jìn)行勻漿3次。冰上進(jìn)行孵育20 min后，4℃15 000 r/min離心20 min，取上清，分裝深低溫冰箱保存，按照BCA蛋白定量試劑盒（cwbiotech）測定蛋白濃度。之后進(jìn)行蛋白PAGE凝膠電泳，10%分離膠，5%濃縮膠（丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，TEMED，Amresco）。電泳條件：濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓130 V，通過預(yù)染蛋白Marker（Biomed）來確定電泳停止時(shí)間。濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流；0.45 μm孔徑PVDF膜（Millipore），轉(zhuǎn)膜時(shí)間1 h。轉(zhuǎn)膜完成后麗春紅染色試劑對膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。之后將膜完全浸沒TBST溶液中（含5%脫脂牛奶），室溫下?lián)u床孵育1 h。將膜與ERK-1一抗（Santa cruz）或者β-actin一抗（Santa cruz，封閉液稀釋）一起孵育，ERK-1的一抗稀釋濃度1∶500，β-actin的一抗稀釋濃度1∶1000，4℃冰箱過夜。次日TBST洗膜3次。二抗孵育：羊抗兔IgG HRP（1∶20 000），孵育40 min（在室溫），洗膜。滴加ECL，反應(yīng)3 min；曝光，顯影，定影。照相，用LabWorks軟件對圖像進(jìn)行灰度分析，計(jì)算出每個(gè)樣本的ERK-1灰度值與相應(yīng)的β-actin的灰度值，取其比值進(jìn)行計(jì)算，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠乳鼠缺氧后表現(xiàn)

缺氧后早期大鼠出現(xiàn)興奮癥狀的表現(xiàn)：躁動不安、翻滾，呼吸加深加快，45 min～1 h后逐漸出現(xiàn)抑制癥狀：反應(yīng)遲緩淡漠、間斷發(fā)作的痙攣、抽搐等。最后進(jìn)入比較穩(wěn)定的反應(yīng)淡漠期，此反應(yīng)一直持續(xù)至缺氧完成，恢復(fù)氧供后乳鼠反應(yīng)逐漸恢復(fù)正常。

2.2 HE染色結(jié)果

對照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，海馬錐體細(xì)胞致密、完整，缺氧組大鼠海馬錐體細(xì)胞核淡染、甚至細(xì)胞核缺如，見圖1。

圖1 兩組大鼠腦組織病理結(jié)果（HE染色，40×）

2.3 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1表達(dá)情況比較

表1 兩組大鼠在6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1的表達(dá)情況比較（x±s）

圖2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1蛋白表達(dá)情況

圖3 兩組大鼠缺氧處理后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1蛋白表達(dá)情況

缺氧組ERK-1表達(dá)呈現(xiàn)動態(tài)性變化，與對照組目前仍存在很大爭議［11-13］。有文獻(xiàn)報(bào)道，自由基清除藥——依達(dá)拉奉可以通過激活ERK-1來減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中毒［14］。Ban等［15］的研究發(fā)現(xiàn)抑制ERK-1能夠惡化腸缺血/再灌注損傷。缺氧發(fā)生之后ERK-1的表達(dá)模式如何尚不明確，本研究通過探討缺氧發(fā)生后ERK-1的動態(tài)表達(dá)模式來進(jìn)一步明確缺氧發(fā)生過程中ERK-1的可能作用，研究發(fā)現(xiàn)，缺氧后腦組織ERK-1表達(dá)水平呈現(xiàn)動態(tài)變化，缺氧后相比，缺氧后ERK-1表達(dá)量基本處于低于正常對照的水平，但是與對照組的變化趨勢趨于一致，第14天時(shí)ERK-1的表達(dá)較對照組有所升高，到第21、28天時(shí)ERK-1的表達(dá)與對照組比較又有所降低。雖然有變化趨勢，但是經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)分析，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具體見表1，圖2、3。

3 討論

缺氧性腦損傷的病理發(fā)生是一個(gè)多因素的復(fù)雜過程，在此過程中，眾多分子參與其中，ERK-1蛋白在腦內(nèi)廣泛存在，是腦功能活動中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子［10］，ERK-1接受刺激信號后活化為磷酸化的ERK-1，從胞漿轉(zhuǎn)位至胞核，通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子等途徑發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。腦缺血再灌注損傷中有ERK-1廣泛參與，但其所發(fā)揮的是保護(hù)性作用還是損傷性作用，第1天開始ERK-1表達(dá)降低，一直到缺氧后第7天達(dá)到表達(dá)的最低值，之后出現(xiàn)表達(dá)情況的上升，缺氧后第14天時(shí)表達(dá)高于正常情況，表達(dá)情況一直持續(xù)到缺氧后第21天達(dá)到最高峰，但是低于正常情況，缺氧后第28天時(shí)表達(dá)又有所降低。根據(jù)折線圖可以看出，ERK-1在大鼠乳鼠發(fā)育過程中呈現(xiàn)一種動態(tài)模式的表達(dá)情況，存在一個(gè)表達(dá)高峰和一個(gè)表達(dá)低谷，提示ERK-1在細(xì)胞的正常發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用，缺氧組的ERK-1的表達(dá)總體比正常情況低下，雖然經(jīng)過分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是存在降低的趨勢，提示在大鼠乳鼠腦組織缺氧損傷過程中ERK-1也存在劑量的變化。需要進(jìn)一步研究ERK-1基因與其他缺氧相關(guān)的基因，如缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia induced factor-1α，HIF-1α）等基因表達(dá)的相互關(guān)系，從而更加明確其參與缺氧腦損傷過程的作用機(jī)制。

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Expression profile of extracellular signal regulated kinase 1 of rat pups in response to hypoxia challenge

YANG LijunCUI Hong
Department of Pediatrics,the Affiliated Beijing Friendship Hospital of Capital Medical University,Beijing100050, China

ObjectiveTo understand the process of extracellular signal regulated protein kinase 1(ERK-1)involved in hypoxic brain injury through the understanding of its expression in hypoxic brain injury in rat brain.Methods48 3-day SD rats were randomly divided into two groups:control group and hypoxia group,24 rats in each group.Rats of hypoxia group were treated with mixed gas which included O2(8%)and N2for 90 minutes,and rat pups of the control group were treated with no treatment.Brain tissues of both groups were obtained at the 1st,3rd,7th,14th,21st day and the 28th day after hypoxia insult.Western blot was used to detect the expression of ERK-1 in brain tissues.ResultsThere were dynamic changes of ERK-1 in brain tissue of rats after hypoxia.It showed decreased expression of total protein of ERK-1 at 1-7 days after hypoxia,and on the 14th day of hypoxia,there seemed to exist a rising trend in the expression of ERK-1.And the expression of ERK-1 decreased again on the 21st and 28th day,with no significant difference (P＞0.05).ConclusionWhen hypoxia happened,there is no significant change in the expression profile of ERK-1 protein,suggesting that ERK-1 may not affect brain tissue by dose regulation after hypoxia insult.

Preterm infant;Hypoxia brain injury;Extracellular-signal regulated kinase 1;Rat

R72

A

1673-7210（2015）02（a）-0008-04

2014-10-15本文編輯：任念）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號81370741）；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號7122045）；基礎(chǔ)臨床科研合作基金與李桓英醫(yī)學(xué)基金會聯(lián)合資助課題（編號11JL-L03）。

崔紅（1961.5-），女，主任醫(yī)師，教授；研究方向：早產(chǎn)兒腦損傷。