趙文艷 朱法根 李 超

HPLC法測(cè)定婦科濕熱清顆粒中連翹苷的含量

趙文艷 朱法根 李 超

（濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，泰興2254 41）

目的建立H PLC法測(cè)定婦科濕熱清顆粒中連翹苷含量的方法。方法以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動(dòng)相為乙腈-水（22∶78），流速1.0 m L/m in，檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，柱溫30℃。結(jié)果連翹苷在16.2μg/m l～162μg/m l濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999，加樣回收率為97.45%，R SD為1.36%。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏、可靠，可用于婦科濕熱清顆粒的質(zhì)量控制。

連翹苷；婦科濕熱清顆粒；高效液相色譜法

婦科濕熱清顆粒是由金銀花、連翹、薏苡仁等12味藥材制成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱利濕之功能。用于濕熱蘊(yùn)結(jié)型盆腔炎性疾病后遺癥（慢性盆腔痛）。方中連翹為君藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱之功效[1]。連翹有廣譜的抗菌作用，且有抗病毒、解熱抗炎和抗肝損傷多種藥理作用[2-3]；其所含的主要有效成分為連翹苷具有較強(qiáng)的抑菌作用[4]，并能抑制CAFP、磷酸二酯酶的活性[5]。為了提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，突出對(duì)君藥連翹的控制，本實(shí)驗(yàn)建立連翹苷作為婦科濕熱清顆粒定量指標(biāo)的含測(cè)方法，以便更好的控制其制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Shimadzu 20A高效液相譜儀（LC-20AT泵，SPD-20A紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、CTO-10ASVP柱溫箱、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器）；Fettler XS205型電子分析天平。連翹苷（批號(hào)：110821-200711，供含量測(cè)定用，含量以98.9%計(jì)，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；婦科濕熱清顆粒（批號(hào)：140715，濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；乙腈、甲醇均為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（22∶78）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm；流速：1.0 ml/min；理論板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 對(duì)照品制備方法取連翹苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含80μg的溶液，即得。

2.3 供試品制備方法取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇30 ml，超聲處理（功率200 W，頻率58 KHz）30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置水浴濃縮約2 mL，加在中性氧化鋁柱（100～200目，2 g，內(nèi)徑為1 cm）上，用70%乙醇100 mL分?jǐn)?shù)次洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn)原處方去除連翹藥材，按制劑工藝制備得連翹的陰性制劑。按照供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液，測(cè)定。

比較對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液和供試品溶液的色譜圖（見(jiàn)圖1、2、3），結(jié)果顯示，陰性樣品溶液在連翹苷相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)吸收峰，表明陰性樣品無(wú)干擾，該方法具有專屬性。

圖1 連翹苷對(duì)照品溶液H PLC色譜圖

圖2 陰性樣品溶液H P LC色譜圖

圖3 供試品溶液H P LC色譜圖

2.5 檢測(cè)靈敏度將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，以信噪比約為10∶1，確定其定量限；以信噪比約為3∶1，確定其檢測(cè)限。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，連翹苷的進(jìn)樣量為10.52 ng；當(dāng)信噪比約為3∶1時(shí)，連翹苷的進(jìn)樣量為3.16 ng。

2.6 線性關(guān)系考察精密稱取連翹苷16.38 mg置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液一；精密量取對(duì)照品溶液一15 mL、10 mL、5 mL、2 mL，分別置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液二、三、四、五。分別精密吸取對(duì)照品溶液一、二、三、四、五各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=6805.5X+ 2420.5，r=0.9999，結(jié)果表明連翹苷在16.2μg/mL～162 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7 對(duì)照品精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一連翹苷對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果對(duì)照品日內(nèi)精密度RSD為0.20%，日間精密度RSD為0.40%，表明該方法進(jìn)樣精密度較好。

2.8 中間精密度試驗(yàn)同一批樣品（批號(hào)140715），不同操作人員、不同時(shí)間、不同儀器設(shè)備，依法進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果RSD為1.5%，表明中間精密度良好。

2.9 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一樣品（批號(hào)140715）供試液10ul，分別于0、2、4、6、8、12、17小時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果樣品穩(wěn)定性RSD為1.45%，表明供試品溶液中連翹苷在17 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)取同一樣品（批號(hào)140715）6份，精密稱定，按供試品溶液制備方法處理，依法測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果6份樣品測(cè)定結(jié)果RSD為0.88%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)取含量已知樣品（批號(hào)140715），進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)。取6份，每份約1.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的連翹苷對(duì)照品溶液（0.034 mg/mL），按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定（見(jiàn)表1）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，連翹苷平均加樣回收率為97.45%，RSD為1.36%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.12 樣品含量測(cè)定取3批樣品（150101、150102、150103）依法檢測(cè)，分別為0.98、0.96、0.99（mg/袋）。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇根據(jù)連翹苷對(duì)照品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)掃描結(jié)果，連翹苷在277 nm有最大吸收，確定其檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm。通過(guò)流動(dòng)相乙腈：水不同比例25∶75[6]、22∶78、19∶81[7]比較，其中22∶78分離度相對(duì)較好，故選擇流動(dòng)相比例為乙腈-水（22∶78）。試驗(yàn)中考察了不同色譜柱（Phenomenex Gemini 5μ C18 110A 250×4.6mm柱（1）、Phenomenex Gemini 5μ C18 110A 250×4.6mm柱（2）及Phenomenex Luna 5μ C18（2）100A 250×4.6mm柱）、不同儀器（Shimadzu 20A高效液相色譜儀和Agilent 1100高效液相色譜儀）的影響，試驗(yàn)結(jié)果連翹苷的分離度及對(duì)稱性均良好，表明該方法系統(tǒng)耐用性均良好。

3.2 供試品溶液制備方法本制劑供試品處理方法考察了萃取法（氯仿、正丁醇）與上中性氧化鋁柱法，結(jié)果表明上中性氧化鋁柱方法雜質(zhì)較少且提取含量較高，故選用上中性氧化鋁柱。同時(shí)考察了不同提取方式（加熱回流、超聲、冷浸30分鐘）、不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇）、不同提取時(shí)間（15 min、30 min、 45 min）、不同溶劑用量（20 mL、30 mL、40 mL）對(duì)婦科濕熱清顆粒中連翹苷提取率的影響；結(jié)果表明甲醇超聲提取連翹苷提取率較高且方法簡(jiǎn)便可行，提取時(shí)間30 min、提取溶劑30 ml可以充分提取連翹苷。此外，還考察了氧化鋁用量（1.5 g、2 g、2.5 g）對(duì)連翹苷提取率的影響，1.5 g含量較高，但吸附不完全，峰形不好；2.5 g峰形較好，但不能完全洗脫，含量較低；2 g峰形較好，且含量較高；故選擇氧化鋁用量為2 g。最后選擇采用加入30 mL甲醇，超聲處理30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置水浴濃縮約2 mL，加在中性氧化鋁柱（100～200目，2 g，內(nèi)徑為1 cm）上，用70%乙醇100 mL分?jǐn)?shù)次洗脫來(lái)制備供試品溶液。以上分析方法驗(yàn)證結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)便、靈敏、可靠，適合婦科濕熱清顆粒的質(zhì)量控制。

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2015年2月10日

ZHAO Wenyan, ZHU Fagen, Li Chao(Jumpcan Pharmaceutical Group Co. , Ltd. , Jiangsu Province, Taixing 225441, China)

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of phillyrin in Fuke Shireqing granules.MethodsOctadecylsilane chemically bonded silica was used as bulking agent.The mobile phase was consisted of acetonitrile-water（22：78）with the flow rate of 1.0mL/min，and the detection wavelength was 277nm，with the column temperature at 30℃.ResultsPhillyrin showed a good linearity in the concentration range of 16.2μg/ml～162μg/ml，the coefficient was 0.9999，the average recovery was 97.45%，and RSD was 1.36%.ConclusionThe method is simple，sensitive and suitable，and can be used for the quality controlof Fuke Shireqing granules.

Phillyrin；Fuke Shireqing granules；HPLC

1672-2779（2015）-20-0147-03

：楊杰本文校對(duì)：李超

2015-08-25）