龔 勛， 牛翠娟， 錢美亞， 周勇相， 王 丹

(1.貴州理工學(xué)院輕工工程學(xué)院，貴州貴陽 550003； 2.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點實驗室，北京 100875；3.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院，貴州畢節(jié) 551700)

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急性冷應(yīng)激對中華鱉幼鱉Vc合成能力和組織Vc含量的影響

龔 勛1,2,3， 牛翠娟2*， 錢美亞2， 周勇相3， 王 丹3

(1.貴州理工學(xué)院輕工工程學(xué)院，貴州貴陽 550003； 2.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點實驗室，北京 100875；3.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院，貴州畢節(jié) 551700)

以中華鱉幼鱉為研究對象，研究了急性冷應(yīng)激對中華鱉幼鱉內(nèi)源Vc合成能力和不同組織Vc含量的影響。在水溫(29±1) ℃條件下，用不添加Vc的基礎(chǔ)飼料對中華鱉幼鱉(體重(206.31±28.33)g)進行投喂，馴化3周后開始急性冷應(yīng)激試驗，應(yīng)激條件為(13±0.7) ℃，6 h。結(jié)果表明，幼鱉在急性冷應(yīng)激6 h后GLO活力較冷應(yīng)激前有所升高，但未達到顯著水平(P>0.05)。冷應(yīng)激前后肝臟組織Vc含量與腦組織Vc含量均未發(fā)生顯著變化。此外，雌性幼鱉與雄性幼鱉的GLO活力存在較大差異，但由于樣本量偏少，尚不能斷定是否確實存在這種性別差異。急性冷應(yīng)激對幼鱉的Vc合成能力具有一定的促進作用，對肝臟組織Vc含量與腦組織Vc含量沒有顯著影響。

急性冷應(yīng)激；L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶；組織Vc含量；中華鱉

中華鱉(Pelodiscussinensis)是我國重要的經(jīng)濟水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，具有較高的食用價值和藥用價值。目前，已在中華鱉腎臟中檢測到L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶(L-gulonolactone oxidase，GLO)活性，表明中華鱉具有內(nèi)源Vc合成能力[1]。研究表明，動物在脅迫環(huán)境下內(nèi)源Vc不能滿足正常生命活動需要，日糧中添加Vc可以降低糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇或皮質(zhì)酮)分泌，避免因其分泌濃度過高而產(chǎn)生的免疫抑制作用，從而提高抗應(yīng)激能力[2]。Zhou等在觀測外源包膜Vc對中華鱉應(yīng)激反應(yīng)的影響時也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激后對照組皮質(zhì)醇水平顯著升高，而Vc添加組皮質(zhì)醇水平?jīng)]有顯著變化[3]。飼料中添加500 mg/kg的Vc多聚磷酸酯，有助于鱘魚對LPS造成的應(yīng)激反應(yīng)[4]。大量研究表明，飼料Vc的添加對動物的免疫力和抗應(yīng)激能力的提高具有一定的促進作用[2-6]。但如果飼料中不添加外源Vc，僅靠中華鱉自身生產(chǎn)的內(nèi)源Vc是否也能滿足其在應(yīng)激條件下的生理需求則有待研究。研究表明，應(yīng)激會影響某些動物內(nèi)源Vc 的合成能力與組織Vc分布。肉仔雞在熱應(yīng)激狀態(tài)下血漿Vc含量降低，肝臟Vc合成能力下降，據(jù)此推測在應(yīng)激狀態(tài)下動物體的GLO活力會受到抑制[7]。動物在遭受氧化脅迫和饑餓應(yīng)激時GLO活力均會受到影響，饑餓應(yīng)激會顯著抑制仔雞的GLO活力[8]。饑餓應(yīng)激會顯著降低豚鼠脾臟、肝臟和腎上腺的Vc含量[9]。此外，饑餓應(yīng)激對GLO活力的影響具有物種特異性。饑餓會降低大鼠的GLO活力，而對灰松鼠則無顯著影響[10]。目前，有關(guān)應(yīng)激對中華鱉自身Vc合成能力和組織Vc含量的影響的研究甚少。筆者研究了沒有外源Vc補充的情況下中華鱉幼鱉在急性冷應(yīng)激下其自身內(nèi)源Vc合成能力與組織Vc含量的變化，評估了急性冷應(yīng)激對幼鱉Vc需求的影響，從而為龜鱉Vc營養(yǎng)生理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物試驗用鱉為2齡幼鱉(前1年孵化)，馴養(yǎng)在80 cm×35 cm×30 cm大小的玻璃缸中。每缸均為2只鱉，水深約15 cm，水溫為(29±1) ℃，養(yǎng)殖用水為曝過氣的自來水，pH 7.9，溶氧量大于5 mg/L。動物馴化期間投喂不含Vc的基礎(chǔ)料，馴化時間為3周。馴化結(jié)束，鱉的體重為(206.3±28.3) g。

1.2 試驗方法隨機挑選健康的中華鱉幼鱉，設(shè)8個平行，每個平行2只鱉。馴化結(jié)束后將鱉饑餓48 h，開始進行急性冷應(yīng)激試驗。應(yīng)激前取樣，各組每個平行取1只鱉。將缸中原有的水迅速泵掉，換上等量提前曝過氣的自來水，水溫為(13.0±0.7) ℃，冷應(yīng)激時間為6 h。應(yīng)激結(jié)束將剩余的幼鱉快速處死并取血，冰上立即解剖，取出肝臟、腎臟和腦組織，用凍存管分裝后放入液氮中，最后轉(zhuǎn)入-80 ℃下冷凍保存?zhèn)錅y。

1.2.1組織中Vc含量的測定。采用高效液相色譜法(HPLC)進行檢測[3]。稱取一定量組織(肝臟或腦)，迅速將其剪碎，并置于小玻璃勻漿器內(nèi)，加入2 ml 15%的偏磷酸迅速而充分地冰上研磨，4 ℃下20 000 g離心20 min后取上清，0.45 μm過濾器過濾，進行高效液相色譜分析，液相色譜分析條件如下：色譜柱：KONTRON C18(5 μm，4.6×250 mm)；流動相：甲醇∶磷酸溶液體積比為6∶94，pH 2.63；檢測波長為243 nm；流速為1 ml/min；進樣量為20 μl。采用外標(biāo)法，峰高定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法同上，只是將待測樣換成不同濃度梯度的Vc標(biāo)準(zhǔn)品。該試驗中測定的是還原態(tài)和氧化態(tài)抗壞血酸的總和(Total ascorbic acid，TAA )。

1.2.2腎臟GLO活力的測定。腎臟GLO活性的測定方法是在Dabrowski等[11]、Maeland等[12]和Ching等[13]的基礎(chǔ)上進行了一些改進。樣品處理：稱取一定量幼鱉腎臟(0.125 g左右)，加入4倍體積冰冷50 mmol/L pH7.4的磷酸緩沖液(含1 mmol/L EDTA，0.2% 脫氧膽酸鈉 Sodium deoxycholate)，迅速置于冰上充分勻漿，4 ℃下15 000 g離心10 min收集上清，取A、B 2支小指管，各加入200 μl上清液、650 μl上述磷酸緩沖液以及50 μl 50 mmol/L谷胱甘肽(Glutathione，購自Sigma公司)溶液，A管作為反應(yīng)管，再加入反應(yīng)底物100 μl 100 mmol/L L-古洛糖酸內(nèi)酯(L-gulonolactone，購自Sigma公司)；B管作為對照管，將底物替換成100 μl上述磷酸緩沖液。2管均在25 ℃孵育3 h，加入1 ml 30%偏磷酸終止反應(yīng)，冰上放置5 min，20 000 g離心20 min后，取上清液，然后按照上述測定Vc的步驟分別測定A、B管中Vc的含量，以組織中的GLO將底物在單位時間內(nèi)催化生成的Vc量為GLO活力單位(μg TAA/h.g組織)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± S.E.)表示，使用統(tǒng)計軟件包SPSS 15對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析。先對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗(One-sample Kolmogorov-Smirnov Test)和方差齊性檢驗(Test of homogeneity of variances)。在滿足這2個條件的前提下，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行分析。如果差異顯著，則用LSD(Least significant difference)進行兩兩比較。若不滿足這2個條件，則采用非參數(shù)檢驗。顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性冷應(yīng)激對中華鱉幼鱉Vc合成能力的影響若不考慮性別因素，中華鱉幼鱉在6 h急性冷應(yīng)激前后GLO活力變化如圖1所示。從圖1可以看出，幼鱉在急性冷應(yīng)激后GLO活力有所升高，但未達到顯著水平(P=0.286)。

若考慮性別因素，中華鱉雌雄幼鱉在6 h急性冷應(yīng)激前后GLO活力變化如表1所示。由表1可知，中華鱉幼鱉在急性冷應(yīng)激前雄性GLO顯著高于雌性(P<0.05)。雌性在急性冷應(yīng)激后GLO顯著的升高(P<0.05)。雄性在急性冷應(yīng)激后GLO有所降低，但不顯著(P>0.05)。

表1 雌雄幼鱉在急性冷應(yīng)激前后的GLO活力變化 μg TAA/h·g

2.2 急性冷應(yīng)激對中華鱉幼鱉組織Vc含量的影響從圖2～3可以看出，中華鱉幼鱉肝臟組織Vc含量和腦組織Vc含量在6 h急性冷應(yīng)激前后均無顯著變化。

3 討論

3.1 急性冷應(yīng)激對中華鱉幼鱉Vc合成能力的影響在經(jīng)歷6 h急性冷應(yīng)激后，中華鱉幼鱉的GLO活力沒有出現(xiàn)下降，反而略有升高。這與以前的一些應(yīng)激研究結(jié)果有所不同。熱應(yīng)激狀態(tài)下肉仔雞GLO活力會受到抑制[7]。仔雞在長時間的饑餓脅迫下的GLO活力受到顯著抑制[8]，而饑餓對灰松鼠的GLO活力則無顯著影響[9]。這可能與研究物種不同、應(yīng)激方式、強度、作用時間不同有關(guān)。一般而言，急性冷應(yīng)激常呈現(xiàn)免疫抑制，而慢性冷應(yīng)激常引起免疫增強，溫和冷應(yīng)激常引起免疫增強，重度冷應(yīng)激引起免疫下降[14]。錢美亞等研究發(fā)現(xiàn)冬眠影響中華鱉稚鱉的GLO活力，稚鱉在冬眠始末的GLO活力無顯著變化，但在冬眠4周時GLO活力出現(xiàn)顯著下降[1]。該研究中應(yīng)激條件為6 h 13 ℃的低溫應(yīng)激，這種短時間的急性冷應(yīng)激不同于慢性應(yīng)激，能在一定程度上刺激幼鱉體內(nèi)Vc的合成，提高GLO活力。由于Vc可以通過間接的方式增強動物對環(huán)境的抗應(yīng)激能力。為了緩解急性冷應(yīng)激對生理活動帶來的影響，動物對Vc的需求有所增加，而該研究結(jié)果表明短時間的急性冷應(yīng)激能在一定程度上促進體內(nèi)Vc的合成。但是，Vc對于應(yīng)激后免疫功能的保護作用應(yīng)與應(yīng)激的強度與類型以及應(yīng)激持續(xù)的時間有關(guān)，在該試驗中可能由于應(yīng)激不是特別強烈，持續(xù)時間也較短，因此幼鱉冷應(yīng)激前后均未出現(xiàn)顯著差異。應(yīng)激強度、持續(xù)時間與Vc需求之間的關(guān)系還需進一步研究。

有些物種的GLO活力還存在性別上的差異，雌性淡水魟的腎臟GLO活力顯著高于雄性[15]。30周齡的成雞中，母雞的腎臟Vc合成能力顯著高于公雞[16]。Jenness等對幾種哺乳動物的研究表明，在大鼠中雄性個體GLO活力高于雌性，而在狗與兔中情況正好相反[10]。Kuo等報道雌雄小鼠肝臟GLO活力與其mRNA表達量均無差異[17]。筆者發(fā)現(xiàn)非應(yīng)激狀態(tài)下雄性中華鱉GLO活力顯著高于雌性，但由于樣本量偏少的緣故，尚不能準(zhǔn)確斷定。有關(guān)中華鱉GLO活力是否具有性別差異，還有待進一步研究。

3.2 急性冷應(yīng)激對中華鱉幼鱉組織Vc含量的影響大量研究表明，應(yīng)激過程對于動物組織中Vc的含量有影響。經(jīng)歷3 h淺水應(yīng)激的菱羊鯛肝臟中Vc含量有顯著下降[18]。在饑餓脅迫下，豚鼠肝臟、脾臟和腎上腺的Vc含量均會顯著降低[19]。長時間的熱應(yīng)激會引起肉仔雞的血漿Vc含量降低[7]。在該研究中，中華鱉幼鱉在6 h急性冷應(yīng)激前后肝臟組織Vc含量和腦組織Vc含量均未發(fā)生顯著變化。這可能與應(yīng)激類型、強度及持續(xù)時間長短有關(guān)，也可能是動物本身代謝機制的差異所造成的。該研究結(jié)果表明，在急性冷應(yīng)激6 h后，幼鱉肝臟中Vc含量有所上升，但差異不顯著。這說明6 h的低溫應(yīng)激對幼鱉肝臟組織Vc含量沒有顯著影響，由于時間較短幼鱉在應(yīng)激過程中消耗的Vc較少，這部分消耗的Vc可以直接從血漿中獲取，對肝臟中Vc含量并無顯著影響。Zhou等研究表明24 h的酸應(yīng)激對中華鱉肝臟Vc含量沒有明顯影響[3]，應(yīng)激對肝臟組織Vc含量的影響可能與應(yīng)激類型強度，應(yīng)激持續(xù)時間及本身的Vc貯存能力有關(guān)。

研究表明，Vc在加速神經(jīng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運方面有重要作用[20]。腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的組成部位，幼鱉在受到急性冷應(yīng)激時優(yōu)先保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)。該研究表明，6 h急性冷應(yīng)激前后幼鱉的腦組織Vc含量無顯著變化，說明短時間的低溫應(yīng)激還沒有對幼鱉的腦組織Vc含量產(chǎn)生明顯的影響，推測幼鱉在受到急性冷應(yīng)激后消耗的Vc優(yōu)先從機體其他部位(血漿或肝臟中)獲取，因此腦中Vc含量在應(yīng)激以后并沒有明顯變化。綜上所述，冷應(yīng)激對于幼鱉組織中Vc的含量的影響與應(yīng)激類型、應(yīng)激強度、應(yīng)激時間及能力有關(guān)。有關(guān)中華鱉幼鱉應(yīng)激前后Vc在機體組織中分布的規(guī)律及轉(zhuǎn)運的調(diào)控機制，有待進一步研究。

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Effects of Acute Cold Stress on Biosynthesis of Vc and Tissue Vc Concentration in JuvenilePelodiscussinensis

GONG Xun1, 2, 3, NIU Cui-juan2*, QIAN Mei-ya2et al

(1. School of Light Engineering, Guizhou Institute of Technology, Guiyang, Guizhou 550003; 2. College of Life Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875; 3. School of Ecological Engineering, Guizhou University of Engineering Sciences, Bijie, Guizhou 551700)

The effect of acute cold stress on biosynthesis of Vc and tissue Vc concentration in juvenilePelodiscussinensiswas investigated. The juvenileP.sinensis(206.31 g ± 28.33 g) were fed with basal diet under 29 ℃±1 ℃. After 3 weeks, the acute cold stress was carried out. Stress condition: 13 ℃±0.7 ℃, 6 h. The results showed that GLO activity elevated to some extent, but not significantly(P>0.05). Liver and brain Vc concentration did not change obviously. In addition, there seemed a sexual difference of GLO activity in juvenileP.sinensis, which could not confirmed due to un-enough samples. The acute cold stress on biosynthesis of Vc has a role in promoting in juvenileP.sinensis, but there was no significant effect on the liver and brain tissue Vc concentration.

Acute cold stress; L-gulonolactone oxidase; Tissue Vc concentration;Pelodiscussinensis

貴州省科學(xué)技術(shù)

(黔科合J字[2013]2007)；貴州省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(201310668002)。

龔勛(1983- )，女，湖南益陽人，副教授，博士，從事分子生理生態(tài)學(xué)研究。*通訊作者，教授，從事動物生理生態(tài)學(xué)研究。

2015-02-11

S 947.1

A

0517-6611(2015)09-118-03