李 羚，李 麗，龔 賽

（保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院，云南 保山 678000）

核桃葉黃酮類化合物的雙水相與超聲耦合提取

李 羚，李 麗，龔 賽

（保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院，云南 保山 678000）

將超聲波提取技術(shù)與丙醇-硫酸銨雙水相分離技術(shù)進(jìn)行耦合，從核桃葉中提取黃酮類化合物，提取率為13.9%。與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑回流提取法（提取率14.2%）相比，該法的提取率略低，但提取過程中體系的溫度不會大幅度升高，可有效地保持黃酮的生物活性，而且雙水相分離使黃酮的純度得以提高。

核桃葉；超聲波提取；雙水相分離；黃酮

有關(guān)研究表明，核桃葉含有維生素 B、C、D、E及胡蘿卜素、揮發(fā)油等多種營養(yǎng)物質(zhì)和核桃醌、核桃甙、鞣質(zhì)及黃酮類等生物活性物質(zhì)［1-2］，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。而如今，對核桃的利用主要是果實(shí)和木材，核桃葉只是被作為肥料或者進(jìn)行焚燒處理，沒有使其價(jià)值得到應(yīng)有的發(fā)揮。

超聲波提取技術(shù)［3］是利用超聲的空化作用對原料細(xì)胞壁的破壞，有助于有效成分的釋放和溶出；同時(shí)，超聲波使提取液不斷震蕩，有利于有效成分的擴(kuò)散；又由于超聲波的熱效應(yīng)使水溫基本保持在57℃，提取過程的系統(tǒng)溫度較低，不會破壞有效成分的生物活性。雙水相萃取分離技術(shù)［4-7］是被廣泛應(yīng)用于生物提取、天然產(chǎn)物分離等領(lǐng)域的一種新型分離技術(shù)。本文將超聲波提取技術(shù)與雙水相萃取分離技術(shù)進(jìn)行耦合，研究核桃葉黃酮的提取分離，以期為開發(fā)利用核桃葉資源提供有效途徑和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

核桃葉（10月采自云南省保山市隆陽區(qū)），清洗，干燥，用旋風(fēng)式粉碎磨粉碎；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑；NaNO2溶液：5%；AlCl3溶液：10%；NaOH溶液：1mol/L；95%乙醇；硫酸銨；正丙醇。

722光柵分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠制造）；AS3120超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；2XZ-1型旋片式真空泵（南京真空泵廠）；FS-11旋風(fēng)式粉碎磨（杭州麥哲儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丙醇－硫酸銨雙水相體系的形成

選擇丙醇-硫酸銨雙水相作為黃酮的提取分離溶劑。丙醇和水完全互溶，但在丙醇水溶液中加入硫酸銨時(shí)，由于硫酸銨的水化作用比丙醇強(qiáng)，丙醇與水的結(jié)合力被削弱，當(dāng)加入的硫酸銨達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，丙醇被排斥出鹽水相，從而形成雙水相。因此，可通過改變硫酸銨的用量、丙醇與水的比例來控制雙水相體系的形成。

1.2.2 核桃葉黃酮的提取與分離

按一定的醇-水料液比，在裝有1.0 g核桃葉粉末的錐形瓶中加入相應(yīng)數(shù)量的丙醇和水。浸泡核桃葉0.5 h后再加入一定量的硫酸銨，超聲波提取一段時(shí)間，抽濾，濾液靜置分層，取出上層丙醇相，用50%乙醇定容至50 mL即得核桃葉黃酮提取液。

1.2.3 核桃葉黃酮提取率的測定

1.2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取充分干燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑0.0572 g，用50%乙醇溶解，然后將其轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，配制成質(zhì)量濃度為0.572mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液最大吸收波長的測定

準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL于25 mL比色管中，用50%乙醇補(bǔ)至12 mL，加入0.7 mL 5%NaNO2搖勻。放置5 min后加入0.7 mL 10%AlCl3，6 min后加入5 mL 1 mol·L-1NaOH，混勻。用50%乙醇稀釋至刻度，10 min后測得其最大吸收波長為505 nm，以試劑空白為參比。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于6支25 mL容量瓶中，按1.2.3.2 中的步驟加入各種試劑，同時(shí)以試劑空白為參比，在505 nm波長處測定吸光度?；貧w方程：A＝8.9621c+0.0199，R2＝0.9988。

1.2.3.4 核桃葉黃酮提取率的測定

取1.2.2中的核桃葉黃酮提取液0.5 mL于25 mL比色管中，按1.2.3.2中的方法測定吸光度，由回歸方程計(jì)算核桃葉黃酮提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響提取率的因素

2.1.1 醇水體積比對黃酮提取率的影響

不同醇水體積比時(shí)的黃酮提取率見圖1。黃酮提取率先隨醇水體積比的增加而增加，在醇水體積比大于0.6后，黃酮提取率變化較小。這是由于醇水體積比較大時(shí)，水的相對體積較小，提取液在超聲波的作用下不斷震蕩，使得一些原本應(yīng)溶于水相的物質(zhì)反而進(jìn)入丙醇相，黃酮的提取率因此受到影響。

圖1 不同醇水體積比時(shí)的黃酮提取率Fig.1 Flavonoids'yield with different alcohol-water ratio

2.1.2 硫酸銨用量對黃酮提取率的影響

不同硫酸銨用量時(shí)的黃酮提取率見圖2。黃酮提取率先隨硫酸銨用量的增加而增加，當(dāng)硫酸銨用量在0.40～0.50 g·mL-1（水中硫酸銨的質(zhì)量）時(shí) ，黃酮的提取效果最好；當(dāng)硫酸銨用量超過0.50 g·mL-1時(shí)，黃酮得率則隨著硫酸銨用量的增加而減少。由于隨著硫酸銨用量的增加，上相丙醇相對濃度增大，對黃酮類化合物的萃取能力增強(qiáng)，黃酮提取率增加。但當(dāng)硫酸的用量超過其在水中的飽和溶解量后，由于在超聲提取過程中固體硫酸銨對黃酮有一定的吸附作用，結(jié)果導(dǎo)致黃酮提取率反而減少。

圖2 不同硫酸銨用量時(shí)的黃酮提取率Fig.2 Flavonoids'yield with different ammonium sulfate concentration

2.1.3 超聲時(shí)間對黃酮提取率的影響

不同超聲時(shí)間時(shí)的黃酮提取率見圖3。黃酮提取率隨超聲時(shí)間的增加先增大，超聲時(shí)間增至25 min時(shí)，黃酮提取率最大，隨后逐漸減小。這是由于隨著超聲時(shí)間的增加，丙醇對黃酮的提取更加充分，但時(shí)間過長，可能有部分黃酮轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)，提取率反而降低。

圖3 不同超聲時(shí)間時(shí)的黃酮提取率Fig.3 Flavonoids'yield with different ultrasonic time

2.1.4 料液比對黃酮提取率的影響

不同料液比時(shí)的黃酮提取率見圖4。黃酮提取率隨料液比的增加而提高，料液比增至1∶50 g/ mL后黃酮提取率增加緩慢?？紤]到節(jié)約試劑，并便于后續(xù)處理等因素，本文選取1∶40、1∶45、1∶50 g/mL的料液比來優(yōu)化提取條件。

圖4 不同料液比時(shí)的黃酮提取率Fig.4 Flavonoids'yield with differentmaterial liquid ratio

2.2 提取條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取優(yōu)化提取條件的因素水平見表1。

表1 優(yōu)化提取條件的因素水平Table.1 Optimize the factor levels of extraction condition

根據(jù)表1，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table.2 Orthogonal experiment results of L9（34）

從表2極差分析看出，黃酮提取率受4因素影響的大小順序?yàn)椋毫弦罕?、超聲時(shí)間、醇水體積比、硫酸銨用量。優(yōu)化得到的最佳提取條件為A2B2C2D3，即0.6的醇水體積比、0.45 g·mL-1的硫酸銨用量、25 min的超聲時(shí)間、1∶50的料液比。在此最佳提取條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，得到黃酮的平均提取率為13.9%，高于正交試驗(yàn)中的最高提取率。

2.3 乙醇水溶液回流提取法的提取率

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比1∶30，回流時(shí)間2 h的條件下進(jìn)行提取，核桃葉黃酮提取率為14.2%，稍高于本法的13.9%。

3 結(jié)語

該方法能有效地提取核桃葉中的黃酮，雖然提取率略低于傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑回流提取法，但其有兩個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)：一是提取過程中體系的溫度不會大幅度升高，可有效地保持黃酮的生物活性；二是溶于丙醇相中的黃酮在雙水相分離時(shí)能與一些水溶性物質(zhì)進(jìn)行分離，使黃酮的純度得以提高。

［1］尉芹，馬希漢，韓學(xué)文，等.核桃葉抗氧化作用的研究［J］.食品科學(xué)，2001，22（7）：81-83.

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Extraction of Flavonoids by Ultrasonic Wave and Aqueous Two-phase System Technology from Walnut Leaves

LI Ling，LI Li，GONG Sai
（Department of Resource and Environment，Bao Shan College，Bao Shan 678000，China）

Flavonoids are extracted from walnut leaves by coupling the ultrasonic extraction technology with propyl alcohol-ammonium sulphate aqueous two-phase extraction technology and the extraction yield can be reached to 13.9%.Compared with conventional organic solvent reflux extraction（extraction yield of 14.2%），this yield is a slightly lower，however by this method，in the extraction process the system temperature dose not rise significantly，and the biological activity of flavonoids could be maintained effectively，meanwhile the aqueous two-phase could improve the purity of flavonoids.

walnut leaves；ultrasonic extraction；aqueous two-phase system；flavonoids

TQ35

A

1004-275X（2015）04-0019-03

12.3969/j.issn.1004-275X.2015.04.006

收稿：2015-05-06

保山學(xué)院科研教研基金重點(diǎn)項(xiàng)目（13BZ012）。

李羚（1963-），女，云南會澤人，教授，liling-bs@163.com。