余志銀，喻明明，羅劍英，蘇 燦，薛泉宏，黃勝雄，孫 蕓，馬亞團(tuán)，*

1 新疆醫(yī)科大學(xué)中藥系，烏魯木齊 830011;2 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201;3 西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，楊凌 712100

鏈霉菌是一類(lèi)高G+C 含量的革蘭氏陽(yáng)性放線菌，廣泛分布于土壤、海洋、極端環(huán)境及一些生物體內(nèi)［1］。鏈霉菌代謝途徑復(fù)雜，能夠產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品、化工、環(huán)保等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值，是新天然活性物質(zhì)的重要源泉。如最著名的生物農(nóng)藥阿維菌素(Avermectins，簡(jiǎn)稱(chēng)Avm)，由美國(guó)Merek 公司于1976 年在日本Kitasato 研究所提供的Streptomyces avermitilis 發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)。其作為一種高效廣譜驅(qū)蟲(chóng)劑，不僅對(duì)線蟲(chóng)而且對(duì)蜱螨類(lèi)(Acarina)、甲蟲(chóng)類(lèi)(Coleoptera)、磷翅目(Lepidoptera)、直翅目(Orthoptera)、雙翅目(Diptera)和膜翅目(Hymenoptera)害蟲(chóng)均有殺滅作用。其它從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的生物農(nóng)藥還有井岡霉素、春雷霉素、農(nóng)抗120、中生菌素等［2］。然而這些生物農(nóng)藥的廣泛使用導(dǎo)致嚴(yán)重的藥物抗性問(wèn)題，故尋找新的潛在的生物農(nóng)藥就顯得至關(guān)重要。

番茄作為一種世界性蔬菜作物，其病害番茄灰霉病、番茄早疫病已成為影響番茄種植和品質(zhì)的主要因素［3-5］。為了尋找新的抗植物病原菌天然活性物質(zhì)，本課題組對(duì)多株鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了活性篩選，得到一株具有較好抑菌活性的鏈霉菌KIBHL8。因此，我們擴(kuò)大了該菌株的發(fā)酵規(guī)模，對(duì)發(fā)酵液中的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取分離，得到了5 個(gè)化合物，結(jié)構(gòu)分別鑒定為:N-乙酰酪胺(1)、N-乙酰色胺(2)、吡咯-2-甲酰胺(3)、Inthomycin C(4)和Inthomycin B(5)(見(jiàn)圖1)，并對(duì)其抗真菌和抗細(xì)菌活性進(jìn)行篩選，旨在確定其中的抗菌活性成分。

圖1 化合物1～5 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-5

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker DRX-500、Avance Ⅲ-600 核磁共振儀(TMS 作為內(nèi)標(biāo)，δ 為ppm)，Waters Xevo TQ-S 型超高壓液相三重四極桿聯(lián)用質(zhì)譜儀;ZQZY-HC 恒溫?fù)u床(上海知楚儀器)，薄層色譜硅膠板和200-300 目柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)，Sephadex LH-20(瑞典AIRTECH 生物化學(xué)試劑公司生產(chǎn))，Hitachi Chromaster 5430 高效液相色譜儀(日立)，YMC-Triat C18型液相色譜柱(250×10 mm I.D.)，中速濾紙(杭州新華紙業(yè)有限公司)，YXQ-LS-18SI 高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?天津市大茂化學(xué)試劑廠，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.2 發(fā)酵菌株

發(fā)酵菌株Streptomyces pactum KIB-HL8 由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物資源研究室薛泉宏教授課題組提供，菌株分離自青海干旱土壤樣本(海西蒙古族藏族自治州德令哈市，東經(jīng)93°06＇40.6″～96°22＇14.9″，北緯35°57＇54.2″～ 37°15＇09.8″)。通過(guò)對(duì)其16S RNA 進(jìn)行基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其序列與Streptomyces pactum AB184398，Streptomyces olivaceus AB249920 的序列相似度分別是99.4% 和99.3%，故將其初步鑒定為密旋鏈霉菌(S.pactum)。菌株KIB-HL8 保藏于昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

固體培養(yǎng)基:為MS 培養(yǎng)基，配方為大豆粉20.0 g/L(煮沸過(guò)濾取濾液)，甘露醇20.0 g/L，技術(shù)瓊脂粉20.0 g/L，pH=7.0。

種子培養(yǎng)基:為T(mén)SB 培養(yǎng)基，配方為胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，右旋葡萄糖2.5 g/L，pH=7.3±0.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基:胰蛋白胨2.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，可溶性淀粉12.0 g/L，玉米漿7.0 g/L，酵母提取物2.0 g/L，CaCO32.0 g/L，NaCl 4.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO41.0 mg/L，MnCl21.0 mg/L，ZnSO41.0 mg/L，pH=7.5-7.8。

PDA:200.0 g 去皮土豆切碎，加入1.0 L 水，煮沸30 min，用四層紗布過(guò)濾除，濾液定容到1.0 L，加20.0 g 瓊脂粉，加熱攪拌使其溶解，再加20.0 g 葡萄糖。

LB:胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，技術(shù)瓊脂粉20.0 g/L，pH=7.4。

將在MS 平板上活化好的菌株接種到20 只裝有50 mL 種子液的250 mL 三角瓶中，置于28 ℃，220 rpm 搖床上培養(yǎng)2 d。

將種子液按10%接種量轉(zhuǎn)接到60 只盛有250 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的1 L 三角瓶中，置于28 ℃，220 rpm 搖床上培養(yǎng)7 d。

1.4 提取與分離

將發(fā)酵液于6000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心20 min。上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，用無(wú)水硫酸鈉干燥，有機(jī)相減壓濃縮后得1.5 g 粗提物。經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10∶0、10∶1、10∶2、0∶10)，得到四個(gè)組分(Frs.A-D)。Frs.B 段過(guò)凝膠色譜Sephadex LH-20，甲醇洗脫，TLC 分析，得到3 個(gè)組分(Frs.B 1-3)。用HPLC 分析后，F(xiàn)rs.B-2段用高效液相色譜制備，用28%～100%甲醇-水梯度洗脫，富集20.2 min 的流份得化合物1(57 mg)，富集37.1 min 的流份得化合物4(1.4 mg)，富集41.3 min 的流份得化合物5(1.0 mg);Frs.B-3 段用高效液相色譜制備，以50%的甲醇-水等度洗脫，富集12.5 min 的流份得化合物2(6.2 mg)。Frs.C段經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20(甲醇洗脫)后，TLC 分析，得到3 個(gè)組分(Frs.C 1-3)，用HPLC 分析后，F(xiàn)rs.C-2段用HPLC 制備，以15%的甲醇-水等度洗脫，富集16.5 min 的流份得化合物3(14 mg)。

1.5 活性測(cè)試(濾紙片法)

將保存于石蠟油中的測(cè)試菌株番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、小麥赤霉病菌(Gibberella saubinetti)、蘋(píng)果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporiodes)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum)、馬鈴薯干腐病菌(Fusarium solani)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、蘋(píng)果腐爛病(Valsa mali Miyabe et Yamada)分別接種至PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，28 ℃避光培養(yǎng)4 d，待其菌落基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿為止即可用。將保存于甘油中的測(cè)試菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)接種至LB 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，28 ℃避光培養(yǎng)12 h，待其菌落基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿為止即可用。

化合物1、2、3、4、5 和卡那霉素均配制成濃度為2.0 mg/mL 的丙酮溶液備用。

取無(wú)菌濾紙片(用打孔器將濾紙片加工成直徑為5 mm)，滴上10 μL 樣品溶液，待溶劑揮干后移入已接菌的培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)皿中心到濾紙片中心的距離約為30 mm 左右，金黃色葡萄球菌放在37℃培養(yǎng)12 h，其他菌株放在28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察抑菌圈大小，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。以空白對(duì)照長(zhǎng)至濾紙片為依據(jù)，測(cè)量菌落邊緣到濾紙片的距離。測(cè)試時(shí)以無(wú)菌水和丙酮為陰性對(duì)照，以卡那霉素為陽(yáng)性對(duì)照，每塊平板中都需有陽(yáng)性對(duì)照［6］。重復(fù)平行做3 次，抑菌圈直徑測(cè)量3 次求平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無(wú)色粉末;分子式C10H13NO2;ESIMS m/z:180［M+H］+;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ:7.00(2H，d，J=8.5 Hz，H-2，6)，6.72(2H，d，J=8.5 Hz，H-3，H-5)，3.31(2H，t，J=7.5 Hz，H-7)，2.66(2H，t，J=7.5 Hz，H-8)，1.88(3H，s，CH3);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ:22.6(CH3)，35.7(C-8)，42.6(C-7)，116.3(C-3，C-5)，130.8(C-2，C-6)，131.3(C-1)，156.9(C-4)，173.25。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］，故鑒定為N-乙酰酪胺。

化合物2 淺褐色油狀物;分子式C12H14N2O;ESI-MS m/z:225［M+Na］+，［M+H］+203;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.55(1H，d，J=7.8 Hz，H-4)，7.32(1H，d，J=7.8 Hz，H-7)，7.08(1H，d，J=7.8 Hz，H-6)，7.06(1H，m，H-5)，7.00(1H，m，H-2)，3.46(2H，t，J=7.2 Hz，H-9)，2.93(2H，t，J=7.2 Hz，H-8)，1.91(3H，s，CH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:173.4(C-1＇)，138.3(C-7a)，128.9(C-3a)，123.5(C-2)，122.4(C-6)，119.7(C-5)，119.4(C-4)，113.4(C-3)，112.4(C-7)，41.7(C-9)，26.4(C-8)，22.7(CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［8］，故鑒定為N-乙酰色胺。

化合物3 白色粉末;分子式C5H6N2O;ESI-MS m/z:111［M+H］+;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ:6.91(1H，dd，J=2.5，1.5 Hz，H-5)，6.80(1H，dd，J=3.5，1.5 Hz，H-3)，6.15(1H，dd，J=3.5，2.5 Hz，H-4);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ:165.9 C-6)，126.4(C-2)，123.3(C-5)，112.9(C-3)，110.3(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］，故鑒定為吡咯-2-甲酰胺。

化合物4 黃色油狀物;分子式C16H22N2O3;ESI-MS m/z:291［M+H］+;1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:7.79(1H，s，H-13)，6.80(1H，s，H-12)，6.39(1H，dd，J=11.4，14.2 Hz，H-6)，6.23～6.18(3H，m，H-8，H-7，NH)，6.02(1H，d，J=11.4 Hz，H-5)，5.76(1H，m，H-9)，5.44(1H，brs，NH)，4.0(1H，brs，H-3)，3.80(1H，brs，OH)，3.49(2H，d，J=4.8 Hz，H-10)，1.79(3H，s，4-CH3)，1.30(3H，s，2-CH3)，1.11(3H，s，2-CH3);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:180.6(C-1)，150.8(C-11)，150.4(C-13)，137.9(C-4)，133.4(C-8)，132.4(C-7)，128.8(C-5)，128.0(C-6)，127.4(C-9)，122.5(C-12)，83.8(C-3)，44.9(C-2)，28.9(C-10)，25.7(2-CH3)，21.7(2-CH3)，13.3(4-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］，故鑒定為Inthomycin C。

化合物5 黃色油狀物;分子式C16H22N2O3;ESI-MS m/z:291［M+H］+;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:8.09(1H，s，H-13)，6.85(1H，s，H-12)，6.56(1H，dd，J=13.8，11.4 Hz，H-6)，6.26(1H，dd，J=15.0，10.8 Hz，H-8)，6.16(1H，dd，J=13.8，10.8 Hz，H-7)，6.01(1H，d，J=11.4 Hz，H-5)，5.76(1H，dt，J=15.0，7.2 Hz H-9)，4.68(1H，s，H-3)，3.51(2H，d，J=7.2 Hz，H-10)，1.79(3H，s，4-CH3)，1.25(3H，s，2-CH3)，1.05(3H，s，2-CH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:183.4(C-1)，153.1(C-13)，152.8(C-11)，139.3(C-4)，134.8(C-8)，132.9(C-7)，130.9(C-5)，129.2(C-6)，128.2(C-9)，122.7(C-12)，75.9(C-3)，46.7(C-2)，29.4(C-10)，26.3(2-CH3)，21.9(2-CH3)，19.8(4-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11］，故鑒定為Inthomycin B。

2.2 化合物抑菌活性結(jié)果

通過(guò)對(duì)10 株病原菌株的測(cè)試，發(fā)現(xiàn)化合物4 對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有抑制活性，對(duì)其他所測(cè)試病原菌沒(méi)有活性;化合物1 和2 對(duì)番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)有抑制活性，對(duì)其他所測(cè)試病原菌沒(méi)有活性;化合物3 對(duì)番茄早疫病菌(Alternaria solani)有較強(qiáng)的抑制活性，對(duì)其他所測(cè)試病原菌沒(méi)有活性;化合物5 對(duì)所測(cè)試病原菌均無(wú)活性(見(jiàn)表1)。

表1 化合物1～5 抑菌圈直徑(mm)Table 1 The diameter of inhibition zone of compounds 1-5(mm)

3 討論

本研究從鏈霉菌Streptomyces pactum KIB-HL8發(fā)酵液中分離得到5 個(gè)化合物，其中化合物1 由Sobolevskaya 等人報(bào)道具有細(xì)胞毒活性，可以抑制海膽胚胎細(xì)胞的增值［12］?；衔? 由張文娟等人報(bào)道對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抑制作用如蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)，對(duì)革蘭氏陰性菌無(wú)明顯活性［13］。另外Inthomycin 類(lèi)化合物是一種惡唑三烯類(lèi)抗生素，Uemura等人在1985 年首次報(bào)道了惡唑霉素A 和新的惡唑霉素，這類(lèi)抗生素具有廣譜、有效的抗菌、抗病毒，抗腫瘤活性［10］。1990 年ōmura 等人從鏈霉菌中首次分到Inthomycin A 和異構(gòu)體Inthomycin B、Inthomycin C。這類(lèi)化合物是一種高度特異性纖維素生物合成抑制劑，并具有很強(qiáng)的抗菌活性和除草活性［10］。中國(guó)是番茄出口大國(guó)，番茄種植面積約145.5 萬(wàn)hm2，保護(hù)地栽培面積已達(dá)21.7 萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量約837.6 萬(wàn)噸且以每年6%～8%的速度增長(zhǎng)，與此同時(shí)番茄上的各種病害也在逐年增加［14］。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)化合物1 和2 對(duì)番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)有抑制活性，化合物3 對(duì)番茄早疫病菌(Alternaria solani)有較強(qiáng)的抑制活性，這為開(kāi)發(fā)新型抑制番茄病害的生物農(nóng)藥提供理論和數(shù)據(jù)指導(dǎo)。

1 Dai FP(代芳平)，Li SW(李師翁).Progress on the secondary metabolites and applications of Streptomyces.Biotech Bull(生物技術(shù)通報(bào))，2014，3(4):30-35.

2 Jiang L(蔣琳)，Ma CZ(馬承鑄).Research advance biological pesticides.Acat Agric Shanghai(上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào))，2000，16:73-77.

3 Xu YH(徐艷輝)，Li Y(李燁)，Xu XY(許向陽(yáng)).Research progress of tomato Fusarium wilt.J Northeast Agric Univ(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2008，39:128-134.

4 Wang ST(王樹(shù)桐)，Hu TL(胡同樂(lè))，Wang XY(王曉燕)，et al.Screening of plant extracts for the fungi toxicity against Botrytis cinerea.J Agric Univ Hebei(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2003，26:61-64.

5 Wu RF(吳仁鋒)，Wang ZH(汪志紅).Preliminary review on Alternaria solani of tomato.Chin Plant Protect(中國(guó)植保導(dǎo)刊)，2009，3:16-18.

6 Fang ZD(方中達(dá)).Research Methods on Plant Diseases.Beijing:China Agriculture Press(中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社)，1979.

7 Zhao PJ，Wang HX，Li GH，et al.Secondary metabolites from endophytic Streptomyces sp.Lz531.Chem Biodivers，2007，4:899-904.

8 Maeda U，Hara N，F(xiàn)ujimoto Y，et al.N-fatty acyl tryptamines from annona reticulata.Phytochem，1993，34:1633-1635.

9 Konig GM，Wfught AD.Two new naturally occurring pyrrole derivatives from the tropical marine sponge Agelas oroides.Nat Prod Lett，1994，5:141-146.

10 Yoshino M，Eto K，Takahashi K，et al.Organocatalytic asymmetric syntheses of inthomycins A，B and C.Org Biomol Chem，2012，10:8164-8174.

11 Henkel T，Zeeck A.Inthomycine，neue Oxazol-triene aus Streptomyces sp.Liebigs Ann Chem，1991，1991:367-373.

12 Sobolevskaya MP，Denisenko VA，Moiseenko AS，et al.Bioactive metabolites of the marine actinobacterium Streptomyces sp.KMM 7210.Russ Chem Bull，2007，56:838-840.

13 Zhang WJ，Wei SP，Zhang JW，et al.Antibacterial activity composition of the fermentation broth of Streptomyces djakartensis NW35.Molecules，2013，18:2763-2768.

14 Ji JJ(紀(jì)軍建)，Zhang XF(張小風(fēng))，Wang WQ(王文橋)，et al.Research progress on control of tomato GrayMold.Chin Agric Sci Bull(中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào))，2012，28:109-113.