劉鐵楠 吳春濤 蘇鵬宇 李素新 張志婓

華北理工大學(xué)，河北唐山 063000

雨 生 紅球藻中蝦 青 素的提取和 穩(wěn) 定性研究

劉鐵楠 吳春濤 蘇鵬宇 李素新 張志婓

華北理工大學(xué)，河北唐山 063000

目的以雨生紅球藻為原料，研究有機(jī)溶劑提取蝦青素的條件及其穩(wěn)定性。方法通過試驗(yàn)選取乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、無(wú)水乙醇和二氯甲烷∶丙酮（2∶1）為提取溶劑，研究不同提取溶劑對(duì)蝦青素提取效果的影響；應(yīng)用試驗(yàn)得到的最佳溶劑分別于 20、30、40、50、60、70、80℃下提取蝦青素，確定最佳提取溫度；在所得到的最適溫度和溶劑下分別提取 1、1.5、2、2.5、3 h 確定最佳提取時(shí)間；設(shè)定提取次數(shù)分別為 1、2、3 次，提取后測(cè)定其OD480，研究提取次數(shù)對(duì)蝦青素提取效果的影響；采用上述實(shí)驗(yàn)中優(yōu)選出的提取溶劑、溫度和時(shí)間，料液比分別取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，1∶30、1∶35、1∶40，提取完成后測(cè)定其OD480，考察不同料液比對(duì)總蝦青素提取率的影響。 測(cè)定蝦青素提取液在不同光照（自然光、日光、避光）、溫度（30、40、50、60、70、80℃）、酸堿度（pH 8～14）等條件下的吸光度，以研究蝦青素的穩(wěn)定性。結(jié)果蝦青素的提取中二次提取可獲得 90%蝦青素，當(dāng)料液比為 1∶25 時(shí)所測(cè)吸光值最大；二氯甲烷∶丙酮（2∶1）為最佳提取液。隨光照強(qiáng)度增加以及堿濃度增加，蝦青素的降解增加。60℃以下，溫度對(duì)蝦青素的影響較小，60℃以上，蝦青素開始受熱破壞。結(jié)論二氯甲烷∶丙酮（2∶1）是最適的提取溶劑，1∶25 為最佳料液比；二次提取后已經(jīng)提取出大部分蝦青素，光照可導(dǎo)致蝦青素的降解，蝦青素對(duì)堿不穩(wěn)定；蝦青素在60℃以下比較穩(wěn)定。

雨生紅球藻；蝦青素；丙酮；提??；穩(wěn)定性

蝦青素（圖 1）是 一種具有很 高 經(jīng)濟(jì)價(jià) 值 和 廣 泛生物活性的類胡蘿卜素，蝦青素的抗氧化能力是 β-胡蘿卜素的 10 倍，是維生素 E 的 500 倍，被稱為“超級(jí)維生素 E”[1-2]，在食品、飼料、保健品、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)均有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。 雨生紅球藻中蝦青素含量為 1.5%～3.0%，被看作是天然蝦青素 的“濃縮品”，已成為近年來(lái)該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]，目前蝦青素的 產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足全球市場(chǎng)的需求量[4-8]。

目前工業(yè)上提取蝦青素 最常用的方法為有機(jī)溶劑提取法，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑具有容易回收、可以重復(fù)利用、成本低以及提取效率高等優(yōu)點(diǎn)[9-16]。 為此，本文選用不同溶劑進(jìn)行比較，對(duì)雨生紅球藻中蝦青素提取物的提取效率進(jìn)行分析，旨在尋找能夠安全、有效地提取雨生紅球藻中蝦青素的有機(jī)溶劑。 另外，還研究了熱、光、pH 值對(duì)蝦青素穩(wěn)定性的影響 ，進(jìn)而得到合理保存蝦青素的條件，以減少在儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和使用過程中的損失。

圖1 蝦青素（astaxanthin）的分子結(jié)構(gòu)式（C40H52O4）

1 儀器與材料

Waters 2695 高效液相色譜儀（美國(guó) Waters 公司），Unico UV-2000 紫外檢測(cè)（美國(guó)尤尼柯 unico 公司），KL-UP-III-80 超純水 機(jī)（成都唐 氏康寧科技 發(fā)展有限公司），PS104S 電子分析天平（德國(guó) Sartorius），SB-100DT 超聲波清洗儀（太原儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司），THZ-92A 氣浴恒溫振蕩器（上海博迅）。 雨生紅球藻為單細(xì)胞藻。 由青島綠萃生物科技有限公司提供實(shí)驗(yàn)材料（批號(hào) 08K0301）。 二氯甲烷、甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 蝦青素含量計(jì)算方法

應(yīng)用下列公式計(jì)算提取液中蝦青素含量[17]：

C（mg/kg）= 4.6×（OD480-0.638×OD645+0.114×OD663）×稀釋倍數(shù)

其中，C 為雨生紅球藻中蝦青素的質(zhì)量濃度（mg/kg）；OD480、OD645、OD663分 別 為 提 取 液 在 480、645、663 nm下的吸光度數(shù)值；稀釋倍數(shù)為提取液最終的體積（mL）與稱取的雨生紅球藻藻粉（冷凍干燥并低溫破碎）質(zhì)量（g）之比。

2.2 蝦青素的提取

2.2.1 蝦青素提取溶劑的確定 選取乙酸乙酯、 丙酮、二氯甲烷、無(wú)水乙醇和二氯甲烷∶丙酮（2∶1）為提取溶劑，研究不同提取溶劑以及混合溶劑之間不同比例對(duì)蝦青素提取效果的影響，應(yīng)用 UnicoUV-2000 測(cè)定其各吸光度值，以選取最佳的提取溶劑。在 480 nm 處測(cè)量吸光度，在幾種溶劑提取物中，二氯甲烷提取物是最高的，同時(shí)其在 645、663 nm 下的吸光度也最高，所以不能斷定運(yùn)用二氯甲烷對(duì)蝦青素進(jìn)行提取是效率最高的，而二氯甲烷∶丙酮（2∶1）的提取液在 480 nm下所測(cè)量的吸光值低于二氯甲烷提取液但高于其他有 機(jī) 溶 劑 提取 液 的 吸 光 值 ， 且 它 在 645、663 nm 下的吸光度與其他有機(jī)溶劑提取液相差并不大，因此可以判定利用二氯甲烷∶丙酮（2∶1）作為溶劑提取蝦青素的效率最高。 見表 1。

表1 不同溶劑蝦青素提取液的吸光度值

2.2.2 提取溫度對(duì)提取效果的影響 取 5 份藻液各 2 mL，加入適量“2.2.1”所得的最佳提取溶劑，分別于 20、30、40、50、60、70、80℃下提取蝦青素。 實(shí)驗(yàn)中設(shè)置 3個(gè)平行樣，提取完成后于 480 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各樣品吸光度。 分析可得，溫度 60℃時(shí)，吸光度最大，因而選60℃為最適提取溫度。 見圖 2。

圖2 不同提取溫度下蝦青素的提取效果比較

2.2.3 最佳提取時(shí)間的確定 取 5 份藻液各 2 mL，采用“2.2.1”中優(yōu)選出的提取溶劑，在“2.2.2”所得最適溫度下分別提取 1、1.5、2、2.5、3 h，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置 3 個(gè)平行樣，480 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。 研究發(fā)現(xiàn)，雨生紅球藻隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，其在 1～2 h 時(shí)提取液的吸光值明顯增加，在 2 h 后略有下降。 故選取提取時(shí)間為2 h。 見圖 3。

圖3 不同浸提時(shí)間下蝦青素的提取效果

2.2.4 提取次數(shù)的確定 取 5 份藻液各 2 mL，采用上述實(shí)驗(yàn)所得的最優(yōu)提取溶劑、提取溫度和時(shí)間進(jìn)行蝦青素的提取，提取完成后離心收集上清液，藻渣重復(fù)上述步驟。 設(shè)定提取次數(shù)分別為 1、2、3 次，以 3 次有機(jī)溶劑提取蝦青素量總和計(jì)為 100%，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置3 個(gè)平行樣，提取后測(cè)定其OD480，研究提取次數(shù)對(duì)蝦青素提取效果的影響。 研究發(fā)現(xiàn)，提取 3 次的蝦青素提取百分比分別為 79.57%、12.24%、8.01%。 2 次提取率大于 90%，因此在雨生紅球藻中提取蝦青素的實(shí)際生產(chǎn)中可采用 2 次提取，以達(dá)到資源的合理利用，減少浪費(fèi)。

2.2.5 料液比對(duì)提取效果的影響 移取 5 份藻液各 2 mL，采用上述實(shí)驗(yàn)中優(yōu)選出的提取溶劑，溫度和時(shí)間，料液比分別取 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，1∶30、1∶35、1∶40，提取完成后測(cè)定其OD480。 研究結(jié)果提示，在 25 倍體積以下時(shí)，隨溶劑的增加其提取效率也迅速上升，但之后增加緩慢。 因此，丙酮提取蝦青素的最佳液料比為 1∶25。 見圖 4。

圖4 不同液料比下蝦青素的提取效果

2.3 蝦青素的穩(wěn)定性

2.3.1 光照對(duì)蝦青素穩(wěn)定性的影響 將蝦青素提取液分別置于室內(nèi)自然光、日光、避光的條件下，每隔一段時(shí)間測(cè)定其OD480，并研究不同光照對(duì)蝦青素穩(wěn)定性的影響。 研究顯示，日光對(duì)蝦青素穩(wěn)定性具有顯著影響（P＜ 0.05），連續(xù)日光照射雨生紅球藻提取液大約4 h 蝦青素就會(huì)遭到完全破壞；室內(nèi)自然光條件下，24 h后測(cè)定雨生紅球藻丙酮提取液的吸光度顯示蝦青素的殘存率為 70%；避光保存時(shí)，蝦青素基本不會(huì)遭到破壞。 見圖 5。

圖5 光照對(duì)蝦青素穩(wěn)定性的影響

2.3.2 溫度對(duì)蝦青素穩(wěn)定性的影響 將雨生紅球藻提取液濃縮后用大豆油溶解，得到的蝦青素色素油盛裝于試管中，分別在 30、40、50、60、70、80℃溫度下，每隔一段時(shí)間測(cè)定其OD480。 研究發(fā)現(xiàn)，30～60℃對(duì)蝦青素的穩(wěn)定性基本沒有影響。 當(dāng)溫度達(dá)到 70℃時(shí)，雨生紅球藻提取液吸光度隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)而逐步下降。 當(dāng)溫度達(dá)到 80℃時(shí)雨生紅球藻丙酮提取液吸光度下降趨勢(shì)最大。 見圖 6。

圖6 溫度對(duì)蝦青素穩(wěn)定性的影響

2.3.3 酸堿度對(duì)蝦青素穩(wěn)定性的影響 調(diào)節(jié)雨生紅球藻丙酮提取液的 pH 達(dá)到 8～14 分別置于比色管中，于室溫避光靜置 4 h 后在 480 nm 下測(cè)定其吸光度。研究顯示，隨著 pH 增大，雨生紅球藻丙酮提取液吸光度明顯下降，說明蝦青素遭到了破壞。 因此蝦青素在堿性溶液中是不穩(wěn)定的，pH 越大，蝦青素被破壞得就越嚴(yán)重。 見圖 7。

圖7 酸堿度對(duì)蝦青素穩(wěn)定性的影響

3 討論

目前，現(xiàn)代生產(chǎn)中提取蝦青素最常用的方法為溶劑萃取法，雨生紅球藻中的蝦青 素 以脂類 形式 存在 ，而蝦青素中脂類種類繁多且有其他胡蘿卜素類，因此蝦青素的提 取和純化一直是蝦青素大規(guī)模生產(chǎn)的最大難題[19-20]。 本研究以雨生紅球藻為基本原料，通過不同溶劑對(duì)比 提取蝦 青 素 ，得出二氯甲烷 ∶丙 酮（2 ∶1） 為蝦青素的最適提取溶劑。 同時(shí)研究料液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)蝦青素的影響，在料液比為1∶25時(shí)所 測(cè)吸 光度 最 大 ；2次提取后可提取出大部分蝦青素 ， 效率較高。在測(cè)定光、熱、堿對(duì)蝦青素穩(wěn)定性的影響中發(fā)現(xiàn)，蝦青素在 光照中不穩(wěn)定，不同光照強(qiáng)度引起蝦青素降解大小順序?yàn)楸芄猓际覂?nèi)光＜室外光，因此蝦青素應(yīng)避光保存為宜；同時(shí)發(fā)現(xiàn)游離蝦青素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，濃度越大，降解越嚴(yán)重，因此蝦青素提取過程中應(yīng)選擇合適的堿濃度和皂化時(shí)間，以減小堿對(duì)蝦青素的降解；溫度在 60℃以下，蝦青素較為穩(wěn)定，而60℃以上，蝦青素開始受熱降解。 因本研究實(shí)驗(yàn)條件所限，未進(jìn)行驗(yàn)證 試驗(yàn)，試驗(yàn)可能存在一定誤差 ；且樣本量較小，對(duì)蝦青素提取過程中對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器精度和試劑質(zhì)量要求高，因此對(duì)于大批量生產(chǎn)提取蝦青素以及提高蝦青素的穩(wěn)定性，尚待進(jìn)一步研究實(shí)施。

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Study on extraction and stability of astaxanthin from Haematococcus pluvialis

LIU Tienan W U Chuntao SU Pengyu LI Suxin ZHA NG Zhifei
North China University of Science and Technology,Hebei Province, Tangshan 063000, China

ObjectiveTo study the conditions and stability of astaxanthin extracted by organic solvent, takingHaematococcus pluvialisas raw materials.MethodsThe ethyl acetate, acetone, methylene chloride, absolute ethyl alcohol and methylene chloride ∶acetone (2∶1) were selected as extraction solvent by experiments, the effect of different extraction solvents for extraction of astaxanthin was studied; the optimum solvent gained from the experiment was used to extract astaxanthin at 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80℃, so as to determine the optimum extraction temperature; under the gained optimum temperature and solvent, the astaxanthin was extracted for 1, 1.5, 2, 2.5, 3 h respectively, so as to determine the optimum extraction time;the extraction times were set as 1, 2, 3 times,OD480was measured after extraction, so as to study the effect of extraction times for extraction of astaxanthin; under the gained optimum solvent, temperature and time in the above experiments,the ratios of material to solvent were taken as 1∶5,1∶10,1∶15,1∶20,1∶25, 1∶30,1∶35,1∶40,OD480was measured after extraction, so as to investigate the effect of different ratios of material to solvent for extraction of astaxanthin. The stability of astaxanthin was researched, and the absorbance of astaxanthin extracting solution was determined at different conditions of light (natural light, sunlight, lucifuge), temperature (30, 40, 50, 60, 70, 80℃), acid-base (pH 8 - 14), and so on.ResultsIn the extraction of astaxanthin, the secondary extraction can obtain 90% of astaxanthin. When the ratio of material to solvent was 1∶25, the measured absorbance was maximum. Methylene chloride∶acetone (2∶1) was the best extracting solution.The degradation of astaxanthin increased with the increase of light intensity and the increase of alkali concentration. Below 60℃, the effect of temperature on astaxanthin was small. Above 60℃, astaxanthin began to be heated and damaged.ConclusionMethylene chloride ∶acetone (2∶1) is best extracting solution, and 1∶25 is the best ratio of material to solvent. the secondary extraction can extract most of astaxanthin, light can lead to degradation ofastaxanthin,astaxanthin is unstable to alkali,astaxanthin is relatively stable below 60℃.

Haematococcus pluvialis; Astaxanthin; Acetone; Extraction;Stability

Q949.9；S986.2

A

1673-7210（2015）08（b）-0025-04

2015-04-03 本文編輯：張瑜杰）

中國(guó)煤炭工業(yè)協(xié)會(huì)科學(xué)技術(shù)研究指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目（MTKJ2014-286）。