史延華，任 磊，賈 陽，閆艷春

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081）

節(jié)桿菌與施氏假單胞菌對(duì)甲基對(duì)硫磷的共降解研究

史延華，任 磊，賈 陽，閆艷春

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081）

為實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥甲基對(duì)硫磷的徹底降解，研究利用有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌施氏假單胞菌Y C-Y H1與對(duì)硝基苯酚降解菌C N2對(duì)甲基對(duì)硫磷進(jìn)行共降解試驗(yàn)，同時(shí)克隆了參與降解過程的相關(guān)基因，并對(duì)2株菌株在對(duì)甲基對(duì)硫磷污染土壤的原位修復(fù)中的效果進(jìn)行研究。結(jié)果表明，與Y C-Y H1單獨(dú)降解相比，Y C-Y H1和C N2共降解在處理前32 h無較大差異；但之后，甲基對(duì)硫磷和對(duì)硝基苯酚的降解速度明顯加快，處理48 h后甲基對(duì)硫磷即被完全降解，比單獨(dú)用Y C-H1降解時(shí)提前了16 h，處理64 h時(shí)對(duì)硝基苯酚就被完全降解。而土壤修復(fù)的研究結(jié)果表明，菌株Y C-Y H1與C N2能夠高效降解甲基對(duì)硫磷，72 h對(duì)土壤中100Mg/k g甲基對(duì)硫磷的降解率接近100%，尤以未滅菌土壤中降解效果更好。

甲基對(duì)硫磷；對(duì)硝基苯酚；施氏假單胞菌；節(jié)桿菌；共降解

生物降解作為消除環(huán)境有機(jī)污染物的方式之一，被認(rèn)為是重要的環(huán)境物質(zhì)平衡策略。由于農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及日常生活中的重要作用，其使用頻率和使用量越來越大[1]，隨之引起的食品安全和環(huán)境污染等問題也越來越受人們關(guān)注。大部分農(nóng)藥是可以降解的，且已有較多相關(guān)的研究報(bào)道，但仍然有許多盲點(diǎn)值得關(guān)注[2]：（1）農(nóng)藥在低濃度下較難被降解，如濃度達(dá)到毫克級(jí)以下時(shí)，不論生物降解還是理化降解成效都不顯著；（2）農(nóng)藥的生物降解在極端條件下較難起作用，例如地下水、湖泊深層淤泥和海水等環(huán)境；（3）農(nóng)藥轉(zhuǎn)化的代謝中間產(chǎn)物也具有相當(dāng)?shù)亩靖弊饔茫瑧?yīng)予以關(guān)注。例如，3,5,6-三氯-2吡啶酚作為毒死蜱的主要降解產(chǎn)物，雖然毒性相對(duì)于毒死蜱大大降低，但由于其半衰期較長，且具有較強(qiáng)的抑菌活性以及潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)生態(tài)環(huán)境及人體健康的威脅不容忽視[3]。

甲基對(duì)硫磷是一種高效、高毒的有機(jī)磷殺蟲劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。但其殘留期長，具有較高神經(jīng)毒性[4-6]。因此，甲基對(duì)硫磷的生物降解一直是人們研究的熱點(diǎn)。目前，已證實(shí)可降解甲基對(duì)硫磷的菌株分別屬于芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、節(jié)桿菌屬、克雷伯氏菌、木霉屬等[7-10]。

有研究表明，微生物的水解酶通常作用于甲基對(duì)硫磷的P-O酯鍵，將甲基對(duì)硫磷水解為二甲基硫代硫酸酯和對(duì)硝基苯酚。雖然對(duì)硝基苯酚的毒性與甲基對(duì)硫磷相比下降了幾十倍[11]，但是其半衰期仍然較長，且具有良好的水溶性，故對(duì)硝基苯酚能夠長時(shí)間殘存于環(huán)境中，并可隨地表水遷移至地下水系統(tǒng)，給生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來較大威脅[12]。因此，研究對(duì)硝基苯酚的生物降解途徑對(duì)徹底解決甲基對(duì)硫磷的污染問題有重要意義。

研究以有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌施氏假單胞菌YCYH1和對(duì)硝基苯酚降解菌節(jié)桿菌CN2為材料，通過基因克隆初步探討2株降解菌對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解途徑，并通過土壤降解試驗(yàn)研究這2株菌株對(duì)污染環(huán)境原位修復(fù)的應(yīng)用潛能，以期為生物修復(fù)甲基對(duì)硫磷污染土壤提供理論依據(jù)與技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 供試菌株 供試菌株為施氏假單胞菌YC-YH1（Pseudomonas stutzeri）和節(jié)桿菌屬細(xì)菌CN2（Arthrobacter sp.），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院生物學(xué)教研室提供；它們的16S rRNA基因序列均已遞交GenBank，登錄號(hào)分別為KJ786450和EU266494。

1.1.2 供試藥品 研究所用甲基對(duì)硫磷（純度97.2%）與對(duì)硝基苯酚（純度99.1%）均為分析純級(jí)（國藥集團(tuán)）。其中，甲基對(duì)硫磷用無水乙醇溶解配制成濃度為2×104mg/L的母液；對(duì)硝基苯酚用純水配制成濃度為2×104mg/L的母液；備用。高效液相色譜使用的乙腈和甲醇均為色譜純級(jí)（美國Fisher公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 普通培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl10 g，去離子水1 L，pH值7.2±0.2。無機(jī)鹽離子培養(yǎng)基（MSM）：NH4NO31.0 g，NaCl 0.5 g，（NH4）2SO40.5g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，去離子水1 L，pH值7.2±0.2。上述培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉即得到對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基，所有培養(yǎng)基均在121℃滅菌30Min備用。

1.1.4 供試土壤與主要試驗(yàn)儀器 供試土壤為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院西門花園內(nèi)土壤，無有機(jī)磷農(nóng)藥使用記錄。高效液相色譜儀為安捷倫1 200（Agilent，USA），色譜柱為Zorbax Eclipse PlusC18（4.6mm×150mm× 5μm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株對(duì)底物的降解效果 施氏假單胞菌YC-YH1降解甲基對(duì)硫磷的效果以及節(jié)桿菌CN2降解對(duì)硝基苯酚的效果通過水解圈試驗(yàn)進(jìn)行展示。具體方法如下：（1）分別制備含100mg/L甲基對(duì)硫磷的LB固體平板和100mg/L對(duì)硝基苯酚的LB固體平板，備用；（2）向LB液體培養(yǎng)基中分別接入YC-YH1與CN2，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600=0.6～0.8），備用；（3）用已滅菌的濾紙片（r=0.8 cm）分別蘸取菌液，放入相應(yīng)的LB固體平板中央（YC-YH1放入含甲基對(duì)硫磷的平板，CN2放入含對(duì)硝基苯酚的平板）；（4）在30℃下避光培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.2 降解相關(guān)基因的克隆 根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道[13-16]，分別選取甲基對(duì)硫磷水解酶基因mpd、有機(jī)磷水解酶基因ophC2和opdA以及對(duì)硝基苯酚降解相關(guān)基因npdA1和npdA2，作為目標(biāo)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列見表1。通過PCR反應(yīng)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱5Min；95℃18 s，60℃18 s，72℃，mpd、ophC2和npdA1為1Min，opdA與npdA2為2Min，循環(huán)34次；72℃10min；10℃30Min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將陽性結(jié)果測(cè)序（上海生工生物工程股份有限公司），對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析并將測(cè)序結(jié)果遞交GenBank。

表1 本研究所用引物及引物序列

1.2.3 YC-YH1與CN2對(duì)甲基對(duì)硫磷的共降解 向LB液體培養(yǎng)基中分別接入YC-YH1與CN2，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。取一定體積的培養(yǎng)液，6 000 rpm離心3Min收集菌體，并用新鮮MSM培養(yǎng)基清洗，再次離心收集菌體，重懸于等體積的新鮮MSM培養(yǎng)基中備用。首先，分別配制含100mg/L甲基對(duì)硫磷和100mg/L對(duì)硝基苯酚的MSM培養(yǎng)基，并按照10%（V︰V）的接種量接種YC-YH1和CN2菌種，其中YC-YH1接入含甲基對(duì)硫磷的MSM培養(yǎng)基，CN2接入含對(duì)硝基苯酚的MSM培養(yǎng)基；以含相同濃度底物但不接菌的MSM培養(yǎng)基作為對(duì)照組；每個(gè)處理3次重復(fù)。于30℃下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 rpm/Min，每8 h取樣1次，分別測(cè)定甲基對(duì)硫磷與對(duì)硝基苯酚的濃度。其次，向含100mg/L甲基對(duì)硫磷的MSM培養(yǎng)基中，同時(shí)接入YC-YH1與CN2各10%。以含相同濃度甲基對(duì)硫磷但不接菌的MSM培養(yǎng)基作為對(duì)照組。每個(gè)處理3次重復(fù)。于30℃下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 rpm/Min，每8 h取樣一次，分別測(cè)定甲基對(duì)硫磷與對(duì)硝基苯酚的濃度。1.2.4 模擬原位土壤修復(fù) 供試土壤過20目篩，部分進(jìn)行滅菌處理（121℃，1 h）。取已滅菌的250ML三角瓶，分別裝入100 g滅菌與未滅菌的土壤，兩種土壤中均加入甲基對(duì)硫磷至終濃度為100mg/kg。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的YC-YH1和CN2菌液，離心收集菌體沉淀，并用新鮮無菌的MSM清洗、重懸，將菌懸液分別加入滅菌土壤和未滅菌土壤中，YC-YH1和CN2至各自濃度約104～105 cfu/g，以不接菌且含相同濃度甲基對(duì)硫磷的未滅菌土壤作為對(duì)照組。在溫度30℃，相對(duì)濕度10%左右的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，每12 h取樣一次，分別測(cè)定甲基對(duì)硫磷和對(duì)硝基苯酚濃度。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.5 甲基對(duì)硫磷和對(duì)硝基苯酚提取 每個(gè)處理組分別取10 g土壤，加入20ML丙酮，在搖床中劇烈震蕩1 h，4℃靜置過夜，取2ML過無水Na2SO4柱收集丙酮溶液，以氮?dú)獯祾呤贡耆珦]發(fā)，加入正己烷使溶質(zhì)復(fù)溶并經(jīng)0.22μm的有機(jī)相濾膜進(jìn)行過濾，此樣品用于甲基對(duì)硫磷濃度檢測(cè)。另取10 g土壤，加入20ML滅菌純水，在搖床中劇烈震蕩1 h，4℃靜置過夜，以0.22μm的濾膜進(jìn)行過濾，此樣品用于對(duì)硝基苯酚濃度檢測(cè)。獲得樣品均使用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 甲基對(duì)硫磷和對(duì)硝基苯酚測(cè)定 制備的樣品經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后，分別在254 nm（甲基對(duì)硫磷）和320 nm（對(duì)硝基苯酚）波長處進(jìn)行濃度測(cè)定。甲基對(duì)硫磷檢測(cè)的流動(dòng)相為甲醇︰乙腈=80︰20，對(duì)硝基苯酚檢測(cè)的流動(dòng)相為甲醇︰乙腈︰水=48︰42︰10，流速均為1ML/Min，柱溫30℃，進(jìn)樣量2μL。同時(shí)采用甲基對(duì)硫磷和對(duì)硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)品繪制樣品濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2=0.993 1，R2=0.987 2）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過SPSS 15.0軟件進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株對(duì)底物的降解效果

水解圈試驗(yàn)?zāi)軌蛑庇^地反映出微生物對(duì)底物的降解能力，不過這一試驗(yàn)通常局限于有顏色變化或渾濁度變化的底物。從圖1中可以看出，接入YC-YH1后，經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，菌株將底物甲基對(duì)硫磷水解成對(duì)硝基苯酚，使得菌株周圍出現(xiàn)黃色的水解圈（圖1A）；接入CN2，經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，菌株將培養(yǎng)基中的對(duì)硝基苯酚降解，使得原本黃色的培養(yǎng)基變?yōu)闊o色，出現(xiàn)一個(gè)透明的水解圈（圖1B）。

圖1 菌株對(duì)底物的降解效果（A：Y C-Y H1降解甲基對(duì)硫磷形成的水解圈，B：C N2降解對(duì)硝基苯酚形成的水解圈）

2.2 降解相關(guān)基因的克隆

以YC-YH1基因組為模板對(duì)mpd、ophC2和opdA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以CN基因組為模板對(duì)npdA1與npdA 2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，mpd、ophC2、npdA1與npdA2結(jié)果為陽性，對(duì)獲得的PCR陽性結(jié)果產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。其中mpd與ophC2基因序列已遞交GenBank并公布，序列分別為KP207597和KP207598，npdA1與npdA2基因序列遞交GenBank但未公布。根據(jù)獲得的參與降解的相關(guān)基因[17-18]，可以推斷，YC-YH1首先通過mpd與ophC2編碼的有機(jī)磷水解酶基因?qū)⒓谆鶎?duì)硫磷水解為對(duì)硝基苯酚與二甲基硫代硫酸酯，CN2進(jìn)一步通過npdA1、npdA2等編碼的對(duì)硝基苯酚降解酶將對(duì)硝基苯酚降解，并進(jìn)入三羧酸循環(huán)被微生物所利用。

圖2 降解相關(guān)基因的克?。∕∶D N AMa k e r，1：n p d A1，2：n p d A2，3：o ph C2，4：o p d A，5：Mp d）

2.3 YC-YH1與CN2對(duì)甲基對(duì)硫磷的共降解

菌株YC-YH1與CN2對(duì)甲基對(duì)硫磷的共降解效果如圖3所示。從圖3A中可以看出，YC-YH1菌株單獨(dú)對(duì)甲基對(duì)硫磷降解時(shí)，甲基對(duì)硫磷在72 h內(nèi)被徹底降解；甲基對(duì)硫磷降解的同時(shí)伴隨著對(duì)硝基苯酚的生成，其濃度在16 h后迅速升高，至48 h后達(dá)到最高并穩(wěn)定在42mg/L左右。從圖3B中可以看出，CN2菌株降解對(duì)硝基苯酚時(shí)，處理64 h后對(duì)硝基苯酚就被徹底降解了。從圖3C中可以看出，用YC-YH1和CN2兩種菌株對(duì)甲基對(duì)硫磷進(jìn)行共降解時(shí)，前期甲基對(duì)硫磷降解速率與單獨(dú)加入YC-YH1時(shí)基本一致；同時(shí)，隨著甲基對(duì)硫磷的降解，對(duì)硝基苯酚生成且濃度逐漸提高，在32 h時(shí)達(dá)到最大（23.2mg/L），但隨即開始被降解，濃度逐漸下降，在64 h后未檢測(cè)到對(duì)硝基苯酚。

與YC-YH1單獨(dú)降解相比，YC-YH1和CN2共降解在處理的前32 h無較大差異；但之后，甲基對(duì)硫磷和對(duì)硝基苯酚的降解速度明顯加快，處理48 h后甲基對(duì)硫磷即被完全降解，比單獨(dú)用YC-H1降解時(shí)提前了16 h；而由于CN2菌株的加入，共降解條件下對(duì)硝基苯酚的濃度顯著低于同時(shí)期YC-YH1單獨(dú)降解時(shí)對(duì)硝基苯酚的濃度，在處理64 h時(shí)，對(duì)硝基苯酚就被完全降解。

圖3 不同處理對(duì)甲基對(duì)硫磷或?qū)ο趸椒拥慕到馇€（A：Y C-Y H 1對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解曲線以及對(duì)硝基苯酚的生成曲線；B：C N2對(duì)對(duì)硝基苯酚的降解曲線；C：Y C-Y H1與C N2對(duì)甲基對(duì)硫磷的共降解曲線）

綜上所述，YC-YH1與CN2兩種菌株在共培養(yǎng)條件下，可將甲基對(duì)硫磷水解為對(duì)硝基苯酚并進(jìn)一步將對(duì)硝基苯酚徹底降解以實(shí)現(xiàn)對(duì)甲基對(duì)硫磷的徹底降解；同時(shí)，當(dāng)體系中對(duì)硝基苯酚的濃度較低時(shí)，YC-YH1菌株降解甲基對(duì)硫磷并未受到明顯影響，而當(dāng)體系中對(duì)硝基苯酚的濃度逐漸升高時(shí)，在一定程度上會(huì)抑制YC-YH1菌株對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解作用。因此，YC-YH1與CN2共降解不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)甲基對(duì)硫磷的徹底降解，同時(shí)還在一定程度上減小了產(chǎn)物反饋對(duì)降解過程的抑制作用。

2.4 YC-YH1與CN2在不同土壤中對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解效果

從圖4中可以看出，不同土壤中甲基對(duì)硫磷降解速率有一定差異。在滅菌土壤中，甲基對(duì)硫磷降解速率相對(duì)緩慢，且當(dāng)甲基對(duì)硫磷濃度低于10mg/kg時(shí)，殘余的甲基對(duì)硫磷很難被徹底降解，始終存在殘留；同時(shí)，降解形成的對(duì)硝基苯酚在32 h時(shí)出現(xiàn)一個(gè)最高峰值（23.2mg/kg），隨后濃度逐漸下降，在72 h以后基本穩(wěn)定在2mg/kg。而在未滅菌土壤中，甲基對(duì)硫磷降解速率明顯比在滅菌土壤中的降解速率快，且處理72 h后，甲基對(duì)硫磷即被完全降解，而對(duì)硝基苯酚產(chǎn)生的趨勢(shì)與滅菌土中基本一致，但峰值僅為滅菌土壤中的一半（9.6mg/kg），且在72 h后被徹底降解。在對(duì)照組中，甲基對(duì)硫磷的濃度下降緩慢，且并未檢測(cè)出對(duì)硝基苯酚。上述結(jié)果表明，在未滅菌的土壤中，土壤中其他微生物可能對(duì)甲基對(duì)硫磷和對(duì)硝基苯酚有一定的協(xié)同降解作用。

圖4 不同土壤中YC-YH1與CN2對(duì)甲基對(duì)硫磷的共降解曲線（A：甲基對(duì)硫磷降解曲線，B：對(duì)硝基苯酚降解曲線）

3 結(jié)論

通常情況下，單一微生物處理很難實(shí)現(xiàn)污染物的徹底降解，因此在獲得污染物降解菌構(gòu)建共降解菌群的同時(shí)，穩(wěn)定降解菌群與土著微生物間的群落結(jié)構(gòu)也非常重要[19-20]。研究通過施氏假單胞菌YC-YH1與節(jié)桿菌CN2的共同作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)甲基對(duì)硫磷的徹底降解，同時(shí)克隆了mpd、ophC2、npdA 1和npdA 2等參與降解過程的基因，并通過分析推斷了它們?cè)诩谆鶎?duì)硫磷降解過程中的作用，最后通過土壤修復(fù)試驗(yàn)初步評(píng)估了施氏假單胞菌YC-YH1與節(jié)桿菌CN2在甲基對(duì)硫磷污染土壤原位修復(fù)中的應(yīng)用潛能。結(jié)果表明，在未滅菌土壤中，處理72 h后甲基對(duì)硫磷和對(duì)硝基苯酚均被完全降解。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Co-degradation of Methyl Parathion by PseudoMonas stutzeri and Arthrobacter sp.

SHIYan-hua，LEIRen，YANG Jia，YAN Yan-chun
（Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,PRC）

To completely degrademethylparathion,Pseudomonasstutzeri YC-YH1 and Arthrobacter sp.CN2were utilized to co-degrade methyl parathion.Cloning of degrading related geneswas conducted to investigate the degrading mechanism.The results showed that compared to the degradation of YC-YH1 alone,therewere no differences in the first32 h w ith the co-degradation of YC-YH1 and CN2. But later,the degradation velocity of parathion-methyl and p-nitrophenol speeded up obviously,only 48 h later,parathion-methylwas degraded completely,and 64 h later,p-nitrophenol was degraded too.In in situ bioremediation assay,strain YC-YH1 and CN2 could efficiently degrademethyl parathion and the degradation rate of 100 mg/kg methyl parathion in soil was almost 100%in 72 hours, especially in non-sterilized soil.

methyl Parathion,p-nitropehnol,Pseudomonasstutzeri,Arthrobacter sp.co-degradation

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.031

X172

A

1006-060X（2015）04-0097-05

2015-05-09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31170119）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)基金資助項(xiàng)目 （0042014006，0042012003，0042011006）

史延華（1983-），男，山東臨朐縣人，博士研究生，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。

閆艷春