梁厚成,馬 挺,龍 潭,張紅兵

·實(shí)驗(yàn)研究·

小鼠視網(wǎng)膜電圖隨生長(zhǎng)發(fā)育的變化特點(diǎn)

梁厚成,馬 挺,龍 潭,張紅兵

目的:研究小鼠視網(wǎng)膜電圖隨生長(zhǎng)發(fā)育的變化特點(diǎn)。

視網(wǎng)膜電圖;小鼠;生長(zhǎng)發(fā)育

引用:梁厚成,馬挺,龍?zhí)?等.小鼠視網(wǎng)膜電圖隨生長(zhǎng)發(fā)育的變化特點(diǎn).國(guó)際眼科雜志2015;15(11):1867-1870

0 引言

視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)是視覺(jué)電生理檢查項(xiàng)目中的一種,主要可用來(lái)檢查視網(wǎng)膜功能,在各種視網(wǎng)膜病變的診治及評(píng)估中有著重要的作用。對(duì)于兒童視網(wǎng)膜疾病及各種遺傳性視網(wǎng)膜疾病的診治,ERG亦有著重要的作用。然而兒童在出生后,視網(wǎng)膜并未發(fā)育成熟,隨著年齡的增長(zhǎng),視網(wǎng)膜功能方可逐漸發(fā)育成熟,同時(shí)由于兒童視網(wǎng)膜中不同種類的細(xì)胞發(fā)育速度的不同[1],導(dǎo)致兒童的ERG與成年人相比有著不同的特征。小鼠因其95%以上的基因組與人類相同,并且可快速繁殖,在出生后2mo內(nèi)即可達(dá)到性成熟,每胎可產(chǎn)仔8只以上,故其可作為多種疾病的模型動(dòng)物。本文研究小鼠在發(fā)育過(guò)程中ERG的變化過(guò)程,以探討小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程及機(jī)制,以及遺傳性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療措施。

1 材料和方法

1.1 材料昆明種二級(jí)小鼠(購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心),共50只(50眼),按觀察的周齡分為5組,每組各10只10眼。所有小鼠在自然光線下飼養(yǎng),不限食水。

1.2 方法[2]

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器使用國(guó)特GT-2000NV(重慶國(guó)特醫(yī)療設(shè)備有限公司)記錄ERG。刺激器為Ganzfeld全野刺激器。記錄電極為自制Ag-AgCl環(huán)狀角膜電極,參考電極和接地電極分別為不銹鋼自制針狀電極,各電極自身阻抗均小于10Ω。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方案及觀察指標(biāo)所有小鼠睜眼時(shí)間均在出生后12～13d。記錄ERG的時(shí)間點(diǎn)為出生后14d (Postnatal 14 days,P14)、21d(Postnatal 21 days,P21)、28d (Postnatal 28 days,P28)、35d(Postnatal 35 days,P35)、56d (Postnatal 56 days,P56)記錄ERG[2]。其中P56小鼠記錄ERG作為成年小鼠的數(shù)據(jù)。2h暗適應(yīng)后,使用速眠新(0.5～0.8mL/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉,同時(shí)復(fù)方托品酰胺點(diǎn)檢查眼4次,進(jìn)行散瞳。在暗紅光條件下放置電極。其中記錄電極貼于角膜表面,并滴加生理鹽水減少阻抗干擾,于左側(cè)頰部皮下置入?yún)⒖茧姌O,同時(shí)接地電極置于尾部。電極安放好后,測(cè)試干擾在適當(dāng)范圍后,繼續(xù)關(guān)燈暗適應(yīng)5min,依次進(jìn)行桿體ERG(Rod-ERG)、最大混合反應(yīng)ERG(Max-ERG)、振蕩電位(OPs)的記錄。記錄條件設(shè)置為:均為單次白色閃光刺激,1min間隔。其后在20cd/m2背景光下進(jìn)行10min明適應(yīng),依次記錄明適應(yīng)ERG(Cone-ERG)、30-Hz閃爍ERG(Flick-ERG)。Cone-ERG為連續(xù)白光閃光刺激,共疊加10次,刺激頻率為2Hz;Flick-ERG刺激光亦為白光,頻率為30Hz,疊加約100次,直至波形平滑為止。Rod-ERG的刺激光強(qiáng)度為1.54×10-2(cd·s)/m2;其他ERG刺激光強(qiáng)度均為2.0(cd·s)/m2。振蕩電位通頻帶為100～300Hz,其余各項(xiàng)均為1～100Hz。Flick-ERG自第2個(gè)正向波開(kāi)始記錄4個(gè)波,取其平均值作為其幅值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)的處理使用SPSS 10.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析,并對(duì)兩兩間比較使用Dunnett T3分析。數(shù)據(jù)以95%可信區(qū)間表示,P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在各周齡間Max-ERG a波、OPs O1波峰潛時(shí)及Flick-ERG幅值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;除P14和P28間Cone-ERG a波峰潛存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外,其他各時(shí)間點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;P14與P21、P28的Cone-ERG b波峰潛時(shí)分別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而P14與其他各時(shí)間點(diǎn)間的Cone-ERG b波幅值、OPs O1、OPs O2波峰潛時(shí)和波幅值、Rod-ERG b波、Max-ERG b波均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。P14時(shí),其中9只小鼠OPs的峰潛時(shí)較成年小鼠明顯延長(zhǎng),而1只小鼠的OPs表現(xiàn)為只有1個(gè)波。P21時(shí),OPs形成5～6個(gè)波。在生長(zhǎng)期間,OPs各波峰潛時(shí)逐漸縮短,測(cè)量O2波數(shù)據(jù)作為OPs的值(圖1)。在出生后各時(shí)間點(diǎn)之間Flick-ERG波幅值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但波形略有不同(圖1)。

表1 小鼠ERG中部分參數(shù)隨生長(zhǎng)發(fā)育的變化

3 討論

ERG是視網(wǎng)膜受到光線刺激后,節(jié)細(xì)胞之前各層細(xì)胞的電活動(dòng)。ERG包括5個(gè)檢查項(xiàng)目,各檢查項(xiàng)目表示的視網(wǎng)膜細(xì)胞成分為:Rod-ERG:視桿細(xì)胞系統(tǒng);Max-ERG:所有視桿和視錐系統(tǒng);OPs:內(nèi)核層;Cone-ERG:視錐系統(tǒng)及少量視桿系統(tǒng);Flick-ERG(30Hz):視錐系統(tǒng)。而本研究以此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠ERG的發(fā)育變化進(jìn)行了初步的研究。

視網(wǎng)膜中包含有光感受器細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、Müller細(xì)胞等7種細(xì)胞,各種細(xì)胞發(fā)育成熟的時(shí)間并不一致[3]。很多物種視網(wǎng)膜在發(fā)育階段經(jīng)歷兩個(gè)階段[4]。早期發(fā)育中,包括錐體細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等在內(nèi)的部分細(xì)胞首先發(fā)育成熟;而在發(fā)育晚期,大部分的視桿細(xì)胞等細(xì)胞才發(fā)育成熟。小鼠視網(wǎng)膜[5]的發(fā)育也大致分為兩個(gè)時(shí)期。從胚胎期第10d(E10)至胚胎期第14d(E14)為早期,而晚期則是從E17持續(xù)至出生后。視桿祖先細(xì)胞在有絲分裂停止后的5.5～12.5d,視桿細(xì)胞方才表達(dá)其特異性抗原Rhodopsin,這提示視桿細(xì)胞在出生后仍處于發(fā)育階段[6-7]。另有研究顯示視桿細(xì)胞的形態(tài)在出生后仍在發(fā)育,P10時(shí)內(nèi)節(jié)已發(fā)育成熟,然而外節(jié)需到P21時(shí)才發(fā)育成熟[8]。同時(shí)視網(wǎng)膜各種細(xì)胞的程序性凋亡對(duì)于視網(wǎng)膜發(fā)揮正常的功能是非常重要的[9]。

本實(shí)驗(yàn)中,Rod-ERG b波在P21達(dá)到成年水平,而這個(gè)時(shí)間恰好是視桿細(xì)胞發(fā)育成熟的時(shí)間。有研究顯示大鼠視桿細(xì)胞外節(jié)長(zhǎng)度以及Rhodopsin水平與Rod-ERG b波有顯著相關(guān)性[10]。因此Rod-ERG b波可能與視桿細(xì)胞、視桿雙極細(xì)胞以及無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞有關(guān)。

圖1 小鼠在P14和P56的ERG。

既往的研究顯示,光感受器細(xì)胞形成Max-ERG a波。本研究中,Max-ERG a波的峰潛時(shí)于P14已達(dá)到成年水平,而幅值達(dá)成年水平的時(shí)間則是P21,這可能提示視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞在接受光刺激后形成電活動(dòng)的時(shí)間是一致的。Max-ERG b波于P21時(shí)達(dá)成年水平,而在P14時(shí)b波幅值較低。Wurziger等[11]認(rèn)為ERG b波起源于on-雙極細(xì)胞和第三級(jí)神經(jīng)元(無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞)。

P14時(shí)OPs O1波峰潛時(shí)已達(dá)成年水平,而幅值則于P21方達(dá)成年水平,這與Max-ERG a波相似。而OPs第二波群幅值和峰潛時(shí)均在P21時(shí)達(dá)到成年水平,與Max-ERG b波的發(fā)育時(shí)間相似。但通常認(rèn)為產(chǎn)生這兩種波形的細(xì)胞是不同的。在人類OPs中,各個(gè)波亦來(lái)自不同的細(xì)胞,其中桿體細(xì)胞系統(tǒng)可能形成O3和O4波[12-13]。本研究表明O1波達(dá)到成年水平的時(shí)間要早于第二波群,這亦可間接提示第二波群起源于視桿系統(tǒng),而O1波則起源于視錐系統(tǒng)。

小鼠Cone-ERG無(wú)明顯的a波,在出生后各時(shí)間點(diǎn)間b波峰潛時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而在P21時(shí)幅值方才達(dá)到成年水平。出生后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)間Flick-ERG的幅值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。既往研究顯示產(chǎn)生Flick-ERG的細(xì)胞包括雙極細(xì)胞以及光感受器細(xì)胞[14]。本研究間接證實(shí)視錐相關(guān)雙極細(xì)胞在P14已經(jīng)發(fā)育成熟,而在P14后視桿細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育可能導(dǎo)致了Cone-ERG b波幅值在P21方達(dá)成年水平。因此無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞及雙極細(xì)胞可能是產(chǎn)生Cone-ERG b波的細(xì)胞。Flick-ERG的波形在P14與成年時(shí)不同,提示視錐系統(tǒng)亦有繼續(xù)發(fā)育的可能。

該研究結(jié)果間接證明了視網(wǎng)膜明視和暗視系統(tǒng)具有不同的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)[3],并與人類不同發(fā)育時(shí)期的ERG相似[1]。本研究顯示昆明種小鼠在不同發(fā)育階段ERG波形不盡相同,在P21時(shí)ERG的各項(xiàng)參數(shù)已達(dá)到成年時(shí)的水平,其中在P14時(shí)視錐系統(tǒng)起源波形已達(dá)成年水平。因此記錄小鼠ERG需考慮不同發(fā)育階段對(duì)波形的影響。

1 Westall CA,Panton CM,Levin AV.Time courses for maturation of electroretinogram responses from infancy to adulthood.Doc Ophthalmol 1998;96(4):355

2張作明,顧永昊,李莉,等.類似先天性靜止性夜盲癥視覺(jué)電生理異常大鼠1例.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)2002;23(1):5-7

3 Young RW.Cell differentiation in retina of mouse.Anat Rec 1985;212 (2):199

4 LaVail MM,Rapaport DH,Rakie P.Cytogenesis in the monkey retina.J Comp Neurol 1991;309(1):86

5 Kilpatrick TJ,Bartlett PE.Cloned multipotential precursors from the mouse cerebrum require FGF-2,whereas glial restricted precursors are stimulated with either FGF-2 or EGF.J Neurosci1995;15(5pt1):3653-3661

6 Cepko CL.The patterning and onset of opsin expression in vertebrate retina.Curr Opin Neurobiol1996;6(4):542-546

7 Morrow EM,Belliveau MJ,Cepko CL.Two phases of rod photoreceptor differentiation during rat retinal development.J Neurosci1998;8(10):3738-3748

8 Richard S.Smith.Systematic evaluation of the mouse eye:anatomy, pathology and biomethods.Boca Raton,Florida,CRC Press2002:46-62

9 Mervin K,Stone J.Developmental death of photoreceptors in the C57BL/6J mouse:association with retinal function and self-protection.Exp Eye Res2002;75(6):703-713

10 Fulton AB,Hansen RM,Findl O.The development of the rod photoresponse from dark-adapted rats.Invest Ophthalmol Vis Sci1995;36 (6):1038-1045

11 Wurziger K,Lichtenberger T,Hanitzsch R.On-bipolar cells and depolarising third-order neurons as the origin of the ERG-b-wave in the RCS rat.Vis Res2001;41(8):1091-1101

12 Janaky M,Goupland SG,Benedek G.Human oscillatory potentials: components of rod origin.Ophthalmologica 1996;210(6):315-318

13 Rousseau S,Lachapelle P.The electroretinogram recorded at the onset of dark-adaptation:understanding the origin of the scotopic oscillatory potentials.Doc Ophthalmol 1999;99(2):135-150

14 Kondo M,Sieving PA.Primate photopic sine-wave flicker ERG: vector modeling analysis of component origins using glutamate analogs. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42(1):305-312

Changes of electroretinogram in mice with the growth and development of retina

Hou-Cheng Liang,Ting Ma,Tan Long,Hong-Bing Zhang

Department of Ophthalmology,Xi'an No.1 Hospital,Xi'an Eye Hospital,Xi'an 710002,Shaanxi Province,China

Foundation item:Subject of Xi'an Science and Technology Bureau (No.YF07136)

Tan Long.Department of Ophthalmology, Xi'an No.1 Hospital,Xi'an Eye Hospital,Xi'an 710002,Shaanxi Province,China.longtan1@sina.com

·AIM:To investigate the changes of electroretinogram in mice with the growth and development of retina.·METHODS:The ERG of 50 mice(50 eyes)of KUNMING at the ages of postnatal 14d(P14),P21,P28,P35 and P56 were measured respectively.The implicit times and amplitudes of b wave of Rod-ERG,a and b waves of Max-ERG,a and b waves of Cone-ERG and O1 and O2 waves of OPs at different ages,as well as amplitude of Flick-ERG,were compared.·RESULTS:The M ax-ERG a-waves(the 95%CI were 15.00～18.60,12.00～15.00,13.20～14.40,13.20～15.00, 13.20～15.00,respectively),OPs O1(the 95%CI were 15.00～19.80,13.80～18.00,13.20～14.40,13.80～15.60, 13.80～15.60,respectively)waves shared the implicit times at the different stages,and the Flick-ERG(the 95% CI were 0.97～3.28,0.85～2.32,0.91～3.49,0.94～2.68, 0.98～3.69μV,respectively)shared the amplitudes also. There was no significant difference among the weeks(P＞0.05).The implicit times of the Cone-ERG a-waves(the 95%CI were 25.20～55.20,27.00～40.20,27.00～38.40,25. 20～43.80,23.40～37.80,respectively)between P14 and P28 were distinct with statistical difference(P＜0.05).The implicit times of Cone-ERG b-waves(the 95%CI were 70.80～88.20,56.40～78.60,60.00～75.60,60.60～87.00, 62.40～81.60m s,respectively)at P14 were statistically different from those at P21 and at P28.The implicit times and amplitudes of Rod-ERG b-waves(the 95%CI were 87.00～114.00,53.40～73.80,52.2～63.6,55.20～71.40, 57.60～67.80m s,and 64.21～195.07,133.79～355.71,130. 62～355.96,190.92～448.97,239.26～462.40μV, respectively),Max-ERG b-waves(the 95%CI were 67.20～107.40,32.40～54.60,31.20～36.60,31.80～42.00,34.20～41.40m s,and 160.64～344.48,281.74～590.09,284.91～716.80,358.64～737.55,406.98～810.55μV,respectively), and OPs O2 waves(the 95%CI were 49.8～69.6,29.40～42.60,28.80～33.60,28.80～37.80,31.20～37.20m s,and 5.43～24.84,54.38～147.52,65.55～201.60,46.33～164.79,49.07～148.32μV,respectively)at P14 were different from those at other stages,and the amplitudes of OPs O1(the 95%CI were 11.60～21.36,6.77～53.71, 32.96～76.42,34.06～70.37,35.58～63.35μV, respectively)and Cone-ERG b-waves(the 95%CI were 5.10～15.85,9.61～24.88,14.96～40.73,14.87～28.54, 13.83～51.98μV,respectively)were from those at other stages also,and there were significant differences.The O1 wave of OPs had been present at P14,but the second cluster of OPs of one mouse(1/10)had not been obvious at the same time.·CONCLUSION:The experiment con firm sthat the different waves come from different cells in retina in mice at certain degree.Due to the change of the ERG in the development of mice,so it should be considered that the different development stages will affect the results when measuring the ERG of mice.

electroretiogram;mice;development

西安市科技局課題(No.YF07136)

作者單位:(710002)中國(guó)陜西省西安市第一醫(yī)院眼科西安市眼科醫(yī)院

梁厚成,畢業(yè)于第四軍醫(yī)大學(xué),博士,主任醫(yī)師,西安市眼科醫(yī)院院長(zhǎng),研究方向:眼科臨床。

龍?zhí)?畢業(yè)于武漢大學(xué),博士,副主任醫(yī)師,西安市眼科醫(yī)院白內(nèi)障病區(qū)副主任,研究方向:白內(nèi)障.longtan1@sina.com

2015-07-10

2015-10-23

:Liang HC,Ma T,Long T,et al.Changes of electroretinogram in mice with the growth and development of retina. Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci)2015;15(11):1867-1870

10.3980/j.issn.1672-5123.2015.11.07

Received:2015-07-10 Accepted:2015-10-23

方法:我們分別測(cè)量50只50眼昆明種小鼠在出生后第14、21、28、35和56d視網(wǎng)膜電圖,分析比較各時(shí)間點(diǎn)Rod-ERG b波、Max-ERG a及b波、Cone-ERG的a及b波、OPs O1及O2波幅值及峰潛時(shí)、Flick-ERG幅值。

結(jié)果:Max-ERG a波峰潛時(shí)(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為15.00～18.60、12.00～15.00、13.20～14.40、13.20～15.00、13.20～15.00ms)、OPs O1波峰潛時(shí)(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為15.00～19.80、13.80～18.00、13.20～14.40、13.80～15.60、13.80～15.60ms)和Flick-ERG幅值(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為0.97～3.28、0.85～2.32、0.91～3.49、0.94～2.68、0.98～3.69μV)在各周齡間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);Cone-ERG a波峰潛時(shí)(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為25.20～55.20、27.00～40.20、27.00～38.40、25.20～43.80、23.40～37.80ms)在出生后14d和28d間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)、出生后14d與出生后21d、28d間Cone-ERG b波峰潛時(shí)(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為70.80～88.20、56.40～78.60、60.00～75.60、60.60～87.00、62.40～81.60ms)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;同時(shí)出生后第14d與其他時(shí)間點(diǎn)間Rod-ERG b波峰潛時(shí)(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為87.00～114.00、53.40～73.80、52.2～63.6、55.20～71.40、57.60～67.80ms)及幅值(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為64.21～195.07、133.79～355.71、130.62～355.96、190.92～448.97、239.26～462.40μV)、Max-ERG b波峰潛時(shí)(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為67.20～107.40、32.40～54.60、31.20～36.60、31.80～42.00、34.20～41.40ms)及幅值(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為160.64～344.48、281.74～590.09、284.91～716.80、358.64～737.55、406.98～810.55μV)、OPs O2波峰潛時(shí)(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為49.8～69.6、29.40～42.60、28.80～33.60、28.80～37.80、31.20～37.20ms)和波幅值(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為5.43～24.84、54.38～147.52、65.55～201.60、46.33～164.79、49.07～148.32μV)以及OPs O1(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為11.60～21.36、6.77～53.71、32.96～76.42、34.06～70.37、35.58～63.35μV)和Cone-ERG b波幅值(各時(shí)間點(diǎn)95%可信區(qū)間依次為5.10～15.85、9.61～24.88、14.96～40.73、14.87～28.54、13.83～51.98μV)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。OPs O1波在P14時(shí)即已存在,而有一只小鼠(1/10)OPs第二波群在第2wk時(shí)波形不明顯。

結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上證實(shí)了小鼠ERG中各波形的起源。由于小鼠ERG在發(fā)育過(guò)程中的變化,在測(cè)量小鼠ERG時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到小鼠發(fā)育階段對(duì)結(jié)果的影響。