齊燕姣，陸會寧，金能智，趙婭敏

（1.西北民族大學(xué)榆中校區(qū)化工學(xué)院，蘭州730124；2.西北民族大學(xué)榆中校區(qū)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730124；3.甘肅省計(jì)算中心，蘭州730000）

doi：10.3969/j.issn.1672－5565.2015.03.01

α?葡萄糖苷酶與米格列醇相互作用及其進(jìn)化關(guān)系

齊燕姣1?，陸會寧2，金能智3，趙婭敏1

（1.西北民族大學(xué)榆中校區(qū)化工學(xué)院，蘭州730124；
2.西北民族大學(xué)榆中校區(qū)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730124；
3.甘肅省計(jì)算中心，蘭州730000）

用生物信息學(xué)的方法分析不同物種的α?葡糖糖苷酶的親緣關(guān)系，分析降血糖藥物米格列醇與甜菜（Beta vulgaris）的α?葡糖糖苷酶相互作用位點(diǎn)在其他親緣關(guān)系較近的物種中相應(yīng)的氨基酸變化特點(diǎn)，結(jié)果表明米格列醇位于一個凹向酶分子內(nèi)部的狹窄的結(jié)合口袋中，其間的相互作用主要以靜電相互作用、氫鍵和范德華力為主。由于米格列醇的強(qiáng)水溶性和多羥基的特點(diǎn)，與酸性的天冬氨酸之間形成多個Ο?Η氫鍵，對甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶具有較好的抑制作用。通過TM?HMM預(yù)測甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶的序列，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)。通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，在米格列醇與甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶相互作用位點(diǎn)處的氨基酸中，在與其親緣關(guān)系較近的5個物種茶（Camellia sinensis），黃瓜（Cucumis sativus），木本棉（Gossypium arboretum），甘庶屬割手密（Spontaneum）和蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula）中有81.82％的氨基酸都是保守的，且主要是極性的氨基酸，如色氨酸和天冬氨酸。這為進(jìn)一步研究降血糖藥物在其他物種中的表現(xiàn)及相互作用提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

α?葡萄糖苷酶；相互作用；序列比對；系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

α?葡萄糖苷酶（α?glucosidase）屬于低聚糖水解酶類，包括麥芽糖酶，異麥芽糖酶、蔗糖酶和海藻糖酶等，對糖的分解代謝具有非常重要的作用。α?葡糖糖苷酶在自然界中分布廣泛，性質(zhì)各異，幾乎存在于所有的生物體內(nèi)，在人類的糖原降解和動物、植物、微生物的糖類代謝方面具有非常重要的生物功能［1－8］。α?葡糖糖苷酶與許多因代謝紊亂失調(diào)而引發(fā)的疾病有密切的關(guān)系，如糖尿病、癌癥、病毒感染等。近年來的研究表明，α?葡萄糖苷酶參與糖蛋白中N－糖鏈的加工，因而在病毒感染以及腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)化中具有重要的地位［9－10］。α?葡萄糖苷酶抑制劑通過競爭性地抑制小腸刷狀緣上皮細(xì)胞的α?葡萄糖苷酶，使淀粉分解成葡萄糖的速度減慢，從而延緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后血糖的升高幅度。因此，尋找合適的抑制劑用于控制和調(diào)節(jié)α?葡萄糖苷酶的活性，對疾病的防治具有重要的臨床意義。

米格列醇是第一類有效的α?葡萄糖苷酶抑制劑，它能顯著降低餐后血清胰島素水平［11］，是由德國Bayer公司于20世紀(jì)80年代初研制開發(fā)并于1997年上市的一種新型α?葡萄糖苷酶抑制劑類藥物［12］。米格列醇（Miglitol）的化學(xué)名稱為1－（2－羥乙基）－2－（羥甲基）－3，4，5－哌啶三醇，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，極性氫原子用數(shù)字進(jìn)行標(biāo)注。米格列醇對胰淀粉酶和α?葡萄糖苷酶具有高親和力，能夠抑制二糖、多糖和復(fù)合糖的水解，延緩葡萄糖和其它單糖的吸收，降糖效果比阿卡波糖和伏格列波糖更為有效［13－15］。盡管到目前已經(jīng)有很多關(guān)于葡萄糖苷酶及其抑制劑之間的相互作用的研究［16－18］，導(dǎo)致藥物對α?葡萄糖苷酶抑制的作用研究受到限制。因此本文通過用生物信息學(xué)的方法分析不同物種的α?葡萄糖苷酶的氨基酸序列特點(diǎn)和進(jìn)化關(guān)系，分析米格列醇與甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶相互作用的位點(diǎn)及其在其他物種中相應(yīng)的氨基酸的異同點(diǎn)，通過分析α?葡萄糖苷酶的疏水性及其與米格列醇結(jié)合位點(diǎn)處的氨基酸特征，為進(jìn)一步了解其他物種的α?葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和分析米格列醇在其他物種中的抑制作用等提供理論依據(jù)。

圖1 米格列醇的二維平面化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The 2－D chem ical structure of them iglitol

1 材料和方法

1.1 蛋白質(zhì)序列的準(zhǔn)備

α?葡萄糖苷酶蛋白質(zhì)的序列是從NCBI網(wǎng)站的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）中下載得到的，α?葡萄糖苷酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)從 PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中下載（PDB ID：3WEL）。

1.2 蛋白質(zhì)序列的特征分析

多序列的比對是通過ClustalX軟件進(jìn)行的［19］；蛋白質(zhì)的氨基酸序列長度和組成及等電點(diǎn)的分析是通過Lasergene軟件進(jìn)行的［20］；序列的相似性分析是通過MegAlign軟件中Lipman?Pearson方法進(jìn)行的［21］；采用DNAMAN（version 4.0，Lynnon Biosoft，Quebec，Canada）和ExPAsy的ProtScale程序分析蛋白質(zhì)的疏水性［22］。用ExPASy提供的在線跨膜區(qū)預(yù)測軟件TMHMM［23］和TMPRED［24］進(jìn)行跨膜區(qū)分析?；贘ones?Taylor?Thornton（JTT）模型，采取缺失序列刪除的方式，用MEGA的Neighbor?Joining （NJ）方法構(gòu)建進(jìn)化樹［25］，Bootstrap Replications設(shè)置為1 000。

1.3 分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化和對接

在Pubchem上下載小分子米格列醇的結(jié)構(gòu)，然后通過Chem3D軟件的MM2法做構(gòu)型優(yōu)化［26］，精確度為0.001。通過Gaussian軟件的密度泛函理論B3LYP的方法和6?31G（D）的基組做進(jìn)一步的幾何優(yōu)化［27］。分子的半柔性對接是用AutoDock4.2進(jìn)行的，采用Lamarckian遺傳算法（LGA），能量評估次數(shù)使用最大次數(shù)2.5×107，突變率設(shè)置為0.02，交叉率為0.80，最大迭代次數(shù)是300。以藥物小分子為中心的格子尺寸定義為6 nm×6 nm×6 nm，間隔為0.037 5 nm，坐標(biāo)為 x＝0.210；y＝－2.258；z＝－22.464。最終得到的50個對接的構(gòu)象中能量最小的作為穩(wěn)定構(gòu)象作進(jìn)一步的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)序列名稱及組成

不同物種的α?葡糖糖苷酶序列名稱及其不同類型氨基酸組成等性質(zhì)如表1所示。其中大部分物種的 α?葡糖糖苷酶的氨基酸序列長度在 500～2 000 aa，但是氨基酸組成成分的比例比較接近，其中疏水性的氨基酸和極性的氨基酸都占有較大的比例，等電點(diǎn)都在5～9。

表1 不同來源α?葡糖糖苷酶的序列名稱及氨基酸組成Table 1 Name and composition ofα?glucosidase am ino acid sequences from different sources

2.2 與藥物作用的關(guān)鍵位點(diǎn)對比分析

α?葡萄糖苷酶對糖類物質(zhì)的消化起著關(guān)鍵的作用［28］，其抑制劑米格列醇因具有良好的降糖效果而被廣泛應(yīng)用。我們通過將米格列醇分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化之后，再分析它與甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶的相互作用，從得到的構(gòu)象中選擇結(jié)合能最低（－6.93 kJ/mol）的構(gòu)象，進(jìn)一步分析其間的相互作用結(jié)合位點(diǎn)（見圖2）。米格列醇與甜菜α?葡萄糖苷酶相互作用的活性位點(diǎn)與酵母菌α?葡萄糖苷酶的作用位點(diǎn)［29］比較相似，米格列醇都位于凹向酶分子內(nèi)部的隧道形狀的狹窄空腔內(nèi)，米格列醇分子緊貼著結(jié)合口袋壁，深入其中，表現(xiàn)了很好的幾何互補(bǔ)性。

從圖3中可以看出，米格列醇基本上位于α?葡萄糖苷酶的一個周圍大多是無規(guī)卷曲的結(jié)合口袋中，米格列醇與酶分子結(jié)合位點(diǎn)處的氨基酸大多是酸性和極性的氨基酸，如TRP329、ASP357、ILE358、ILE396、 TRP432、 TRP467、 ASP469、 MET470、ARG552、TRP565、ASP568和PHE601，其間的相互作用主要以靜電相互作用、氫鍵和范德華力為主。其中天冬氨酸Asp357的OD1與米格列醇的氫原子H3和 H4之間形成兩個 Ο?Η氫鍵，鍵長分別是0.180 1 nm和0.211 3 nm。天冬氨酸Asp568的氧原子OD1和OD2分別與米格列醇的氫原子H1和H2之間形成兩個Ο?Η氫鍵，鍵長分別是0.211 8 nm和0.192 1 nm，圖中以綠色的虛線表示。這一點(diǎn)與酵母菌α?葡萄糖苷酶的作用特點(diǎn)比較相似，都能夠與米格列醇分子之間形成4個氫鍵，特別是與天冬氨酸Asp之間，如N原子連接側(cè)鏈的羥基H和Asp214的氧原子之間、六元環(huán)上的羥基H和Glu276的氧原子之間及側(cè)鏈上的羥基 O和 H分別與 Arg439和Asp349形成的氫鍵。正是由于米格列醇的強(qiáng)水溶性和多羥基的特點(diǎn)［30－34］，才可以與α?葡萄糖苷酶的親水性氨基酸形成較強(qiáng)的相互作用，與天冬氨酸的羧基氧原子之間形成多個氫鍵，因而對α?葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制作用。研究表明，米格列醇具有更廣泛的抑制作用，其原因可能是米格列醇與葡萄糖結(jié)構(gòu)更為相似，更易接近酶的活性中心［35－38］。例如，盡管甜菜與酵母菌的 α?葡萄糖苷酶（SWISS PROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，序列號：P 53 341）的一級序列的相似性很低（通過Lipman?Pearson Parameters方法得到的僅有22.0％），但是它們與米格列醇的作用方式卻極其相似。

圖2 米格列醇與α?葡萄糖苷酶相互作用結(jié)合位點(diǎn)Fig.2 The binding site of the interaction between miglitol andα?glucosidase

圖3 米格列醇與α?葡萄糖苷酶之間的相互作用Fig.3 Interaction between miglitol andα?glucosidase

2.3 α?葡萄糖苷酶的序列特點(diǎn)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的生物功能，疏水性是20種氨基酸均固有的特性，是決定蛋白質(zhì)最終三維空間構(gòu)象的重要因素之一，它在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成過程中起到了關(guān)鍵性作用［39－41］。用 ExPASy的Protscale程序計(jì)算甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶的疏水性圖譜（見圖4）?？v坐標(biāo)0值以上為疏水區(qū)，0值以下為親水區(qū)?？v坐標(biāo)代表疏水性的分值，分值越高，疏水性越強(qiáng)，橫坐標(biāo)代表氨基酸的位置。從圖中可以看出，親水性的氨基酸比例大于疏水性的氨基酸。其中疏水性值最高值是3.55，最低值是－3.37。而在米格列醇與甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶相互作用的位點(diǎn)處的氨基酸中，大多都是親水性的氨基酸。此外，通過TMHMM預(yù)測甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶的序列，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)（見圖5）。

圖4 Beta vulgaris的α?葡萄糖苷酶氨基酸序列的疏水性分析Fig.4 Hydrophobicity analysis forα?glucosidase sequence of the Beta vulgaris

圖5 Beta vulgaris的α?葡萄糖苷酶氨基酸序列的跨膜區(qū)分析Fig.5 Transmembrane region analysis forα?glucosidase sequence of the Beta vulgaris

2.4 α?葡萄糖苷酶的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

不同物種來源的α?葡萄糖苷酶的序列組成和特點(diǎn)都不相同。通過對甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶與其他物種的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)甜菜（Beta vulgaris）與意蜂（Apismellifera）、泡盛曲霉（Aspergil?lus Awamori）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（As?pergillus oryzae）、人（Homo sapiens）、熊蜂（Bombus di?versus diversus）、茶 （Camellia sinensis）、衣 藻（Chlamydomonas reinhardtii）、黃瓜（Cucumis sativus）、木本棉（Gossypium arboretum）、皺紋盤鮑（Haliotis dis?cus hannai）、甘蔗屬割手密（Spontaneum）、蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula）、單細(xì)胞生物（Oxytricha tri? fallax）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、嗜熱真菌（Thermomyces lanugi?nosus）的序列相似性分別是36.4％、37.1％、39.1％、39.2％、18.2％、62.5％、36.7％、45.6％、61.9％、40.2％、39.8％、53.2％、47.0％、27.9％、35.2％、32.2％、32.3％和24.7％。從α?葡糖糖苷酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹圖6中可以看出，甜菜（Beta vulgaris）與親緣關(guān)系較近的茶（Camellia sinensis）、黃瓜（Cucumis sativus）、木本棉（Gossypium arboretum）、甘蔗屬割手密（Spontane?um）、蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula）的相似性都高于45.0％。

圖6 α?葡萄糖苷酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree ofα?glucosidase amino acid sequences

然而，通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，在米格列醇與Beta vulgaris的α?葡萄糖苷酶相互作用位點(diǎn)處的11個氨基酸中，有81.82％的氨基酸在這五個物種中都是高度保守的（序列對比數(shù)據(jù)見圖7）。只有18.18％的氨基酸是不同的，例如，與甜菜（Beta vulgaris）上的Trp329的色氨酸對應(yīng)的只有茶（Camellia sinensis）和甘蔗屬割手密（Spontaneum）是酪氨酸Tyr，其他三個物種中也都是色氨酸；與甜菜（Beta vulgaris）上的Ile358的疏水性的異亮氨酸對應(yīng)的只有黃瓜（Cucu?mis sativus）和蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula）是天冬氨酸Asp，氨基酸的極性也不相同。也就是說，這些不同來源的α?葡萄糖苷酶與米格列醇相互作用的大部分氨基酸都是保守的，且主要是極性的氨基酸，如色氨酸和天冬氨酸。即使是在非保守的氨基酸中，大部分的氨基酸也具有相同的極性。

圖7 α?葡萄糖苷酶氨基酸序列的多序列比對Fig.7 Mutiple?alignment ofα?glucosidase am ino acid sequences

3 結(jié) 論

研究表明體內(nèi)的α?葡萄糖苷酶在調(diào)節(jié)血糖的過程中起著非常重要的作用，可以作為抗糖尿病藥物的作用靶點(diǎn)［42］。目前通過抑制酶活性的方法進(jìn)行疾病的治療已經(jīng)成為藥物研究領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)。然而，由于各種限制因素，目前對于α?葡萄糖苷酶的抑制作用的研究僅僅限于少數(shù)幾種物種，對其他物種來源的α?葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)和抑制作用的研究有助于深入研究藥物的降血糖作用機(jī)制和進(jìn)一步的藥物設(shè)計(jì)、合成等。本實(shí)驗(yàn)基于生物信息學(xué)和分子對接方法分析目前市場上常用的降血糖藥物米格列醇與甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶的相互作用及其位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)米格列醇基本上位于α?葡萄糖苷酶的一個隧道形狀的狹窄空腔內(nèi)，具有很好的幾何互補(bǔ)性。米格列醇與酶分子結(jié)合位點(diǎn)處的氨基酸大多是酸性和中性極性的氨基酸，且是無規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)。其間的相互作用主要以靜電相互作用、氫鍵和范德華力為主，其中與酸性的天冬氨酸之間可以形成多個Ο?Η氫鍵，氫鍵的形成有利于提高復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而進(jìn)一步證實(shí)了米格列醇較強(qiáng)的抑制作用。

疏水性分析表明，甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶是屬于親水性的氨基酸，可以與水溶性的、多羥基藥物產(chǎn)生較強(qiáng)的作用［43－47］。最后，通過系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析表明，米格列醇與甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶的相互作用的相關(guān)氨基酸在親緣關(guān)系較近的物種間是非常保守的，特別是在能夠與米格列醇形成氫鍵的氨基酸，這也可以說明米格列醇對其他物種的α?葡萄糖苷酶具有相似的抑制作用和位點(diǎn)。米格列醇的確是一種很好的α?葡萄糖苷酶的抑制劑，它通過位于一個凹向酶分子內(nèi)部的狹窄的結(jié)合口袋中而與目標(biāo)蛋白酶具有很好的契合。通過TMHMM預(yù)測甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶的序列，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)，此蛋白酶主要分布在膜外。通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，在米格列醇與甜菜（Beta vulgaris）的α?葡萄糖苷酶相互作用位點(diǎn)處的氨基酸中，在與其親緣關(guān)系較近的物種中大部分都是保守的，主要是極性的氨基酸，如色氨酸和天冬氨酸。

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Interaction and evolutional analysis ofα?glucosidases and Miglitol

QIYanjiao1?，LU Huining2，JIN Nengzhi3，ZHAO Yamin1
（1.Department ofChemical Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730124，China；
2.Department of Life Science and Biological Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730124，China；
3.Gansu Province Computing Center，Lanzhou 730000，China）

The phylogenetic relationship of α?glucosidase between different species was analyzed by using the method of bioinformatics.By analyzing the interaction site between the hypoglycemic drug Miglitol andα?glucosidase of Beta vulgaris，and the characteristics of corresponding amino acid in other close genetic species，we found that Miglitolwas located in a narrow binding pocket which recesses inside to the enzyme molecule.The interactions between them aremainly electrostatic interactions，hydrogen bonds and van derWaals forces.There are multiple O?H hydrogen bonds between drug and the enzyme molecules，which makes Miglitol a better inhibition because of the characteristics of strongwater?solubility and polyhydroxy of the Miglitol.Through TMHMM prediction of the Beta vulgarisα?glucosidase sequence，it was found that there is no transmembrane region.The multiple sequence alignment suggested that 81.82％of the amino acids located in the interactive sites between Miglitol and Beta vulgarisα?glucosidasewere conservative among the closest genetic species Camellia sinensis，Cucumis sativus，Gossypium arboretum，Spontaneum and Medicago truncatula.Among the conserved amino acids，the polar ones，such as Asp and Trp，were the most.This bioinformatics?based analysis can provide important scientific basis for further behavioral research of the hypoglycemic drugs in other species.

α?glucosidase；Interaction；Sequence alignment；Phylogenetic relationships

TP925＋.4

A

1672－5565（2015）03－141－09

2015－06－10；

2015－07－11.

國家民委科研項(xiàng)目（14XBZ021）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（NO.31920130035）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（zyz2011064）。

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齊燕姣，女，副教授，研究方向：生物信息學(xué)；E?mail：qiajiao＠163.com.