褚洪標(biāo)，汪小英，張燕軍，曾 紅，周秋貴

井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉安 343009

黃柏為蕓香科植物黃樹皮(Phellodendron chinense Schneid.)及黃檗(Phellodendron amurense Rupr.)的干燥樹皮，為傳統(tǒng)中藥材，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡的功效［1，2］。現(xiàn)代藥理研究表明，其主要成分有生物堿類以及多種黃酮類、黃柏內(nèi)酯等化合物，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒及其他病原微生物等多種作用［3］。超微粉碎技術(shù)應(yīng)用于中藥領(lǐng)域具有提高藥物生物利用度、降低服用量、改善制劑品質(zhì)、有利于難溶性成分的溶出等方面的優(yōu)勢［4-7］。黃柏屬于皮類藥用植物，細(xì)胞壁結(jié)合緊密，不利于有效成分的溶出，因此對黃柏進(jìn)行微粉化是必要的。

本實(shí)驗(yàn)采用近年來新興的中藥材超微粉碎技術(shù)粉碎黃柏，通過對不同粒度黃柏粉體顯微特性和主要成分鹽酸小檗堿的提取率及累積溶出率進(jìn)行比較，考察超微粉體與普通粉體的差異，為中藥黃柏的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

黃柏樣品于2014年5 月購于江西省吉安市，由井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室梁兆昌教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹(Phellodendron chinense Schneid.)的干燥樹皮。鹽酸小檗堿對照品(北京盛世康普化工技術(shù)研究院，批號(hào)633-65-8，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以98%計(jì));胃蛋白酶［酶活力(U/g)≧1200.0］，胰蛋白酶［酶活力(U/g)≧50000］;乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 儀器

ZN-400A 高速中藥粉碎機(jī)(浙江省瑞安市飛達(dá)藥材器械廠)、HM-701 超微粉碎機(jī)(北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司)、S-3500N 掃描電鏡(日本日立公司)、Mastersizer 2000 激光粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)、Nicolet5700 傅立葉紅外光譜儀(美國尼高力公司)、RC-6D 溶出度測試儀(天津市光學(xué)儀器廠)、LC-10AT 型高效液相色譜儀(日本島津)、DV215CD 型電子天平(美國奧豪斯)、SL-250 型超聲波清洗器(上海生析超聲儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃柏粉體的制備、粒度測定及細(xì)胞破壁率計(jì)算

制備超微粉體時(shí)，設(shè)置超微粉碎機(jī)相關(guān)參數(shù)(主機(jī)頻率、風(fēng)機(jī)頻率)和粉碎機(jī)部件狀態(tài)(進(jìn)樣調(diào)節(jié)器、研輪調(diào)節(jié)器等、出料閥門)進(jìn)行粉碎。在粉碎過程中粉體的粒徑主要受風(fēng)速的影響，而風(fēng)速主要由風(fēng)機(jī)頻率控制，故在實(shí)驗(yàn)中主要通過調(diào)節(jié)風(fēng)機(jī)頻率來制備不同粒徑的粉體。實(shí)驗(yàn)中為探究不同粒徑粉體特性而設(shè)置了高、中、低三個(gè)不同風(fēng)機(jī)頻率60、40、20 Hz。

黃柏藥材經(jīng)充分干燥后，利用粉碎機(jī)粉碎得黃柏普通粉體;再利用超微粉碎機(jī)將經(jīng)預(yù)粉碎后的黃柏藥材(普通粉體)進(jìn)行粉碎，分別得到不同粒徑的黃柏超微粉體，四個(gè)不同粒徑的黃柏粉體分別記為黃柏普通粉體、60 Hz 超微粉體、40 Hz 超微粉體、20 Hz 超微粉體。

利用激光粒度儀測定以上四種粉體的粒徑，并繪制出以體積為基準(zhǔn)的粒徑頻率分布圖和累積分布圖，得到各粉體的中位徑D50值。理想破壁模型單元的細(xì)胞破壁率的計(jì)算公式為:n＞1 時(shí)，破壁率η=1-(1-1/n)3，n≤1 時(shí)，破壁率η=100%(n 為粉末粒徑與細(xì)胞直徑的比值)。李雅［8］等對多種中藥材的各種細(xì)胞尺度進(jìn)行分析，最后認(rèn)為細(xì)胞最小尺寸可按10 μm 進(jìn)行確定，本實(shí)驗(yàn)亦以此標(biāo)準(zhǔn)作為理想破碎模型的細(xì)胞直徑。

2.2 粉體的表面形貌觀察

分別取黃柏普通粉體、60 Hz 超微粉體、40 Hz超微粉體、20 Hz 超微粉體適量，鋪于掃描電子顯微鏡(SEM)樣品臺(tái)上，噴金鍍膜后置SEM 下放大500倍觀察黃柏粉體的結(jié)構(gòu)及表面形態(tài)。

2.3 黃柏粉體堆密度及休止角的測定

分別取適量不同粒徑大小的黃柏粉體，運(yùn)用漏斗法來測量，用50 mL 刻度的量筒，木棍輕敲使其堆積結(jié)實(shí)測定其體積V，運(yùn)用堆密度公式ρ=m/V，求得堆密度ρ，重復(fù)三次，求得堆密度平均值。

休止角的大小反映粉體顆粒之間相對運(yùn)動(dòng)自由程度，運(yùn)用漏斗法測量，休止角公式:θ=arctg(2H/R):R-圓錐體半徑，H-圓錐體高度。影響休止角大小的因素是復(fù)雜的，包括物料混合程度、顆粒大小、表面性質(zhì)、荷電、濕度、堆積體的顆粒位置分布等［9］。

2.4 黃柏粉體紅外光譜比較

傅立葉紅外光譜技術(shù)具有樣品用量少、分辨率高、掃描速度快等特性，利用該技術(shù)進(jìn)行同種類不同粉碎粒徑的藥材分析鑒別，取得了很好的效果。本實(shí)驗(yàn)利用傅立葉紅外光譜溴化鉀壓片法，對黃柏普通粉體與超微粉體進(jìn)行測試，比較其紅外譜圖特征。

2.5 黃柏粉體相對提取率比較

分別取黃柏不同粒徑粉體各約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入甲醇25 mL，稱得總重，將錐形瓶放在超聲波清洗器(頻率為40 KHz，功率為120 W)中超聲提取20 min，冷卻后，稱重，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻?yàn)V過，取續(xù)濾液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，收集濾液。按上述方法改變超聲時(shí)間，分別超聲提取40 min、60 min 即得供試品，利用HPLC 方法對供試品進(jìn)行鹽酸小檗堿的含量測定，比較黃柏不同粒徑粉體提取率的高低。

2.6 黃柏不同粉體溶出度實(shí)驗(yàn)

分別取2.1 項(xiàng)下制備的黃柏普通粉體、60 Hz超微粉體、40 Hz 超微粉體、20 Hz 超微粉體各約3 g，精密稱定，投入溶出儀中，按照中國藥典2010年版二部附錄溶出度漿法測定法［10］，以已超聲脫氣的900 mL 蒸餾水為溶劑，漿法，轉(zhuǎn)速為100 rpm，溫度為(37±0.5)℃，分別于5、15、30、45、60 min 各取樣5 mL，同時(shí)向溶出杯中補(bǔ)充相同溫度和體積的水，將取出來的樣品濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm 濾膜，得到以蒸餾水為溶出介質(zhì)的供試品，待測含量。按上述方法，根據(jù)中國藥典2010年版一部附錄［11］項(xiàng)下制備人工胃液、人工腸液，溶出實(shí)驗(yàn)步驟同蒸餾水，分別得到以人工胃液、人工腸液為溶出介質(zhì)的供試品，利用HPLC 方法對供試品進(jìn)行含量測定，比較黃柏不同粒徑粉體相對累積溶出率的高低。

2.7 樣品含量測定

2.7.1 色譜條件

Shimpack ODS 色譜柱(4.6 ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50，含0.1%的十二烷基硫酸鈉);檢測波長為265 nm;流速為1 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

2.7.2 對照品溶液制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品0.300 mg 置10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相溶液定容為每1 mL 含0.030 mg 的鹽酸小檗堿對照品儲(chǔ)備液。

2.7.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.7.2 項(xiàng)下制備的鹽酸小檗堿對照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μL，在2.7.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程:Y=2 ×106x+230399，r=0.9996，表明線性關(guān)系良好。

2.7.4 精密度試驗(yàn)

取鹽酸小檗堿對照品儲(chǔ)備液，在2.7.1 項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣5 次，測定峰面積，其RSD 為0.95%(n=5)，說明儀器精密度較好。

2.7.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品(40 Hz 超微粉體提取40 min)溶液，分別于0、2、4、8、10、12 h 在2.7.1 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定峰面積，其RSD 為1.19%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取5 份同批次的黃柏40 Hz 超微粉體0.5 g，按2.5 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，超聲40 min，在2.7.1條件下測得峰面積，其RSD 為1.09 %。

2.7.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已測定含量的黃柏40 Hz 超微粉體樣品5份，加入鹽酸小檗堿對照品適量，按照2.5 項(xiàng)下的方法操作，超聲40 min，制得供試品溶液，在2.7.1 條件下測得峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿平均回收率為101.87%，其RSD 為1.39%。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 黃柏細(xì)胞破壁率

黃柏普通粉體、60 Hz 超微粉體、40 Hz 超微粉體、20 Hz 超微粉體的中位徑D50值分別為210.333、57.517、34.276、44.424 μm。黃柏經(jīng)超微粉碎后，中位徑D50最小可達(dá)到34.276 μm，說明超微粉碎可使黃柏藥材粒徑大大減小。根據(jù)細(xì)胞破壁率計(jì)算公式得出黃柏普通粉體、60 Hz 超微粉體、40 Hz 超微粉體、20 Hz 超微粉體的破壁率分別為13.60 %、43.60 %、64.50 %、53.50 %。以上結(jié)果表明，隨著超微粉體粒徑的減小，粉體的破壁率增大，但粒徑減小到一定程度，破壁率反而下降。

3.2 粉體的表面形貌觀察

通過觀察黃柏普通粉體、60 Hz 超微粉體、40 Hz超微粉體、20 Hz 超微粉體，從整體上可以看出黃柏顆粒大小在逐漸減小(如圖1 所示)，普通粉體顆粒大小形狀不規(guī)則，表面粗糙，可以看到原藥材的粉末特征，比較黃柏超微粉體和普通粉體，黃柏超微粉體大小逐漸有均勻的趨勢，顆粒表面越來越光滑，原藥材特征越來越不明顯。

圖1 黃柏普通粉體(A)、60 Hz 超微粉體(B)、40 Hz 超微粉體(C)、20 Hz 超微粉體(D)的電鏡掃描結(jié)構(gòu)(×500)Fig.1 SEM photographs (×500)of common (A)，60 Hz (B)，40 Hz (C)，20 Hz (D)powders of P.chinensis

3.3 堆密度及休止角的測定

黃柏普通粉體、60 Hz 超微粉體、40 Hz 超微粉體、20 Hz 超微粉體的堆密度及休止角數(shù)據(jù)見表1。由表1 可知，黃柏粉體的堆密度在一定粒徑范圍內(nèi)隨著粒徑的減小而減小，原因是在一定質(zhì)量下，粒徑越小，粉末表面積逐漸變大，顆粒間的摩擦力逐漸增大，妨礙粉末顆粒的堆積，堆積體積增大，堆密度減小;當(dāng)小于這個(gè)臨界點(diǎn)時(shí)，粒徑顆粒太細(xì)，在用木棒輕敲時(shí)，顆粒會(huì)較好的對堆積空隙填充，堆積體積減小，堆密度反而增大。表1 數(shù)據(jù)顯示，休止角隨著粉體粒徑減小而增大，原因是測定同一種粉體或顆粒時(shí)，粒徑越小，它的相互粘附力越大，粉體的流動(dòng)性減弱，從而導(dǎo)致休止角增大。

表1 黃柏粉體堆密度及休止角的測定(n=3)Table 1 Measurement of bulk density and angle of repose of powders from P.chinensis (n=3)

3.4 黃柏粉體紅外光譜

本實(shí)驗(yàn)利用傅立葉紅外光譜測定黃柏普通粉體與超微粉體的官能團(tuán)吸收特征，比較其紅外譜圖特征，四個(gè)樣品在3420、2926、1740、1430、1200 cm-1處分別有羥基、甲氧基、內(nèi)酯羧基、不對稱二甲基以及C-C 鍵，C-O 鍵的不對稱振動(dòng)吸收，四個(gè)樣品吸收峰峰值偏差在±20 cm-1內(nèi)，主要官能團(tuán)不發(fā)生變化，表明黃柏超微粉碎不破壞其化學(xué)成分，能夠保持黃柏的生物活性。

3.5 相對提取率

根據(jù)2.5 項(xiàng)下的方法制備供試品，在2.7.1 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。對照品鹽酸小檗堿和供試品HPLC 圖譜見圖2。

圖2 鹽酸小檗堿對照品(A)和供試品溶液(B)HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of berberine hydrochloride standard (A)and sample (B)

利用峰面積，由2.7.3 項(xiàng)下線性方程計(jì)算得到鹽酸小檗堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)一步計(jì)算出相對提取率，見圖3。分析圖3 可知，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，超聲時(shí)間越長提取率增加不明顯，甚至?xí)档?如60 Hz 超微粉體)。在同一提取時(shí)間內(nèi)比較不同粒徑的提取率可知，超微粉體的提取率大于普通粉體(20 Hz 超微粉體除外)，說明超微粉碎有利于黃柏成分的溶出;在同一時(shí)間內(nèi)比較超微粉體間的提取率可知，粒徑越小不一定提取率就越高(如20 Hz 超微粉體)。

圖3 黃柏不同粒徑粉體超聲提取的相對提取率Fig.3 Relative extraction yield of ultrasonic extraction of different powders of P.chinensis

3.6 相對累積溶出率

在2.7.1 色譜條件下，進(jìn)行供試品含量測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各供試品中鹽酸小檗堿的累積溶出量，分別以所測得的鹽酸小檗堿最大峰面積值對應(yīng)的累積溶出量作為100%，其他累積溶出量與之相對比，得出各供試品鹽酸小檗堿的相對累積溶出率，以相對累積溶出率為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，繪制累積溶出度變化曲線，見圖4。

分析圖4 可知，以水為溶出介質(zhì)時(shí)，60 Hz 超微粉體、40 Hz 超微粉體的相對累積溶出率較大，而20 Hz 超微粉體的相對累積溶出率比普通粉體還要小。以人工胃液為溶出介質(zhì)時(shí)，40 Hz 超微粉體的相對累積溶出率較大，60 Hz 超微粉體與普通粉體相對累積溶出率差異不大，20 Hz 超微粉體的相對累積溶出率數(shù)值最小。以人工腸液為溶出介質(zhì)時(shí)，60 Hz超微粉體、40 Hz 超微粉體的相對累積溶出率較大，20 Hz 超微粉體的相對累積溶出率數(shù)值最小。超微粉體間比較，并不是粒徑越小溶出率越大，本實(shí)驗(yàn)中60 Hz 和40 Hz 超微粉體的粒徑溶出率最大，進(jìn)一步說明了適度的超微粉碎是必要的。

圖4 黃柏粉體在蒸餾水(A)、人工胃液(B)、人工腸液(C)溶出介質(zhì)的相對累積溶出率示意圖Fig.4 Relative cumulative dissolution rates of distilled water (A)，simulated gastric fluid (B)and simulated intestinal fluid (C)of different powders of P.chinensis

4 討論

4.1 色譜條件的選擇

關(guān)于黃柏中鹽酸小檗堿含量測定的色譜條件不一，本實(shí)驗(yàn)在借鑒《中華人民共和國藥典》(2010)中的色譜條件:以乙腈-0.1%磷酸溶液(50 ∶50)(每100 mL 加十二烷基磺酸鈉0.1 g)為流動(dòng)相的基礎(chǔ)上，將十二烷基磺酸鈉換為十二烷基硫酸鈉，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在此條件下峰形對稱性較高，無拖尾現(xiàn)象，且其與其他成分分離度、重現(xiàn)性好，故本次實(shí)驗(yàn)采用乙腈-0.1 %磷酸溶液(50∶50)(每100 mL 加十二烷基硫酸鈉0.1 g)為流動(dòng)相［12］。

4.2 測定成分的選擇

黃柏的主要成分為鹽酸小檗堿，作為抗菌藥在臨床上已應(yīng)用多年，其療效確切，是一種廣譜抗菌藥物。現(xiàn)代研究證明小檗堿有抗腫瘤、抗心律失常、降壓、降血糖等作用，在臨床上有越來越廣泛的應(yīng)用，需求量日益增加?！吨腥A人民共和國藥典》(2010)規(guī)定黃柏按干燥品計(jì)算，含小檗堿以鹽酸小檗堿計(jì)，不得少于3.0%。因此本次實(shí)驗(yàn)通過測定鹽酸小檗堿的提取率和溶出度來比較不同粉體之間的含量差異。

4.3 提取率提取方法的選擇

中藥常用的提取方法有超聲提取和回流提取等方法。有關(guān)文獻(xiàn)［13］表明，通過這兩種方法，分別超聲提取20、40、60 min，回流提取1、2 h，以提取率為指標(biāo)，超聲40 min 的效果最好，回流2 h 的效果雖優(yōu)于超聲40 min，然而回流提取操作繁瑣，誤差較大，因此采用超聲提取的方法來比較不同粉體間提取率的高低。也可采用傳統(tǒng)浸泡法提取，但是提取工藝繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且提取率不高。

有關(guān)文獻(xiàn)［14］中通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察超聲提取的頻率、次數(shù)、時(shí)間等因素對鹽酸小檗堿提取率的影響，結(jié)果表明60 KHz 超聲提取3 次，每次20 min的提取率最高。因此本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為20、40、60 min，通過不同的時(shí)間來比較不同粒徑粉體之間的提取率。

4.4 不同溶出介質(zhì)的選擇

由于藥物在人體內(nèi)的吸收有著極其復(fù)雜的情況，為了探究黃柏在人體內(nèi)外的溶出情況，本次實(shí)驗(yàn)按照2010 版《中華人民共和國藥典》第二部溶出度測定法槳法模擬蒸餾水、人工胃液和人工腸液，通過設(shè)置5 個(gè)不同的取樣點(diǎn)，測定其有效成分的溶出情況，進(jìn)而比較其在人體內(nèi)的溶出情況。綜合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從溶出量來看，不論是在水、胃液還是腸液中溶出，60、40 Hz 超微粉體的溶出量較大;從溶出介質(zhì)來看，在人工腸液中的溶出率略大于在水、人工胃液的溶出率，說明該成分在堿性環(huán)境中更有利于溶出。

5 結(jié)論

通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析可知，在一定范圍內(nèi)，隨著粉體粒徑的減小，堆密度減小，休止角增大。超微粉碎后粉體(粒徑從大到小)平均粒徑大小逐漸有均勻的趨勢，顆粒表面越來越光滑，原藥材特征越來越不明顯，且微粉化技術(shù)的應(yīng)用并未改變原藥材的主要官能團(tuán)結(jié)構(gòu)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適度的超微粉碎有利于黃柏成分的溶出，但如果粒徑太小，反而影響超微粉體的溶出效果，原因可能有以下兩個(gè)方面:一是超微粉碎技術(shù)可提高細(xì)胞破壁率，使有效成分溶出阻力減小，且超微粉體具有較大的分散性和較強(qiáng)的吸附性，從而提高了有效成分的溶出速率。二是超微粉體具有較大的比表面積和表面能，使各粉體之間處于非穩(wěn)定狀態(tài)，最終因強(qiáng)烈的吸引作用而達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，這種吸引作用導(dǎo)致顆粒之間相互團(tuán)聚從而影響溶出效果。

伴隨著超微粉碎藥物粒度的減小，其溶解度和溶解速度不會(huì)無限增大，并且由于粒徑的減小容易導(dǎo)致表面能增加，使顆粒處于不穩(wěn)定狀態(tài)，易聚集形成假大顆粒，易吸潮，易吸附空氣中的雜質(zhì)，影響吸收，增加存放難度［15，16］。對于藥用植物皮類藥材，由于不同藥材有不同的組織結(jié)構(gòu)，每一種藥材其超微粉體的適宜粒徑不盡相同，因此對不同藥材的超微粉碎都要適度。

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