王鎮(zhèn)南 黃 顥 林瓊燕 鄒 琳 唐 志 李淑慧

(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東湛江524001)

宮頸癌又稱宮頸浸潤癌，是最常見的婦科惡性腫瘤，嚴重威脅女性生命健康，發(fā)病率和死亡率呈逐年升高的趨勢。全世界每年大約有新發(fā)病例50萬，其中80%以上發(fā)生在發(fā)展中國家［1，2］。細胞因子在介導機體針對病原微生物的免疫反應、自身免疫耐受以及維持機體內環(huán)境平衡等過程中起了重要作用［3-5］。白介素35(interleukin-35，IL-35)是 IL-12 家族的新成員，被認為是一種具有潛在治療前景的新型抗炎因子［6］。目前認為IL-35可能廣泛參與了體內的免疫應答過程，不僅在細胞內感染及炎癥過程中起著重要的調節(jié)作用，而且與自身免疫病和腫瘤等多種臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，成為細胞因子研究的新熱點，為感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤的生物治療提供了新思路［7］。然而，關于IL-35在宮頸癌手術前后血液標本中的表達及其與臨床預后的關系目前國內外尚未見相關報道。本研究通過檢測73例宮頸癌患者手術前后血清中IL-35的表達水平，探究其對患者臨床預后的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料

73例宮頸癌患者手術前后外周血液標本取自2009年1月至2014年1月就診于我院行宮頸癌手術切除的患者，所有標本均為經病理學檢查確診的宮頸癌，全部病例獲取前均未行化療和放療，臨床資料完整。73例宮頸癌患者中，年齡18～86歲，中位年齡55歲，55歲以下患者32例，55歲以上患者41例;Ia期20例，Ib期29例，IIa期24例;鱗癌41例，腺癌23例，腺鱗癌9例;淋巴結轉移28例，無淋巴結轉移 45例;人乳頭瘤病毒(human papilloma virusr，HPV)(+)63例，HPV(－)10例;35例正常血液標本取自正常女性體檢血液標本，體檢證實未患腫瘤及其他疾病。所有患者均簽署知情同意書。隨訪:全部73例患者出院后均隨訪，隨訪方式為電話隨訪，隨訪內容包括一般情況、臨床癥狀及影像學檢查。隨訪起點為手術日期，末次隨訪時間為2014年7月31日，至隨訪截止日，依然生存35例，死亡38例，無失訪病例。

1.2 分組情況

患者入組標準如下:①組織學明確診斷的宮頸癌，包括鱗狀細胞癌，腺癌，腺鱗癌;②FIGO分期為臨床分期為 Ia-IIa期;③年齡18～86歲;④既往無并發(fā)癥;⑤美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)體能評分0～2分;⑥ 肝腎功能正常，血清轉氨酶(AST，ALT)≤60 IU/mL，總膽紅素≤1.5 mg/dL，肌酐≤1.5 mg/dL，尿素氮≤20 mg/dL;⑦ 骨髓功能正常:中性粒細胞≥1 500/mm且血小板≥100 000/mm。排除標準如下:① 既往放療史或化療史;② 既往腫瘤病史;③妊娠;④精神障礙。

1.3 ELISA分析血清IL-35的表達

使用不含熱原和內毒素的試管收集血液后，1000×g離心10 min將血清和紅細胞迅速小心地分離(操作過程中避免任何細胞刺激)，將收集到的血清分成小部分 －70℃保存，避免反復冷凍。行ELISA檢測時將所有樣品及試劑解凍，充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。加入稀釋好后的標準品50μL于反應孔、加入待測樣品50μL于反應孔內;立即加入50μL的生物素標記的抗體;蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1 h。甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次;每孔加入80μL的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min;甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干;每孔加入底物A、B各50μL，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10 min。避免光照;取出酶標板，迅速加入50μL終止液，加入終止液后應立即測定結果;在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。血液標本中IL-35 mRNA的表達差異采用One way ANOVA分析。IL-35的表達與各臨床病理參數(shù)之間的關系使用Chi-Square檢驗;生存分析用Kaplan-Meier法。組間生存曲線差別用對數(shù)秩檢驗(logrank test);應用Cox比例風險模型分析影響宮頸癌預后的因素，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌患者臨床病理特征

73例宮頸癌患者年齡18～86歲，具體臨床病理特征見表1。

表1 宮頸癌患者的臨床病理特征(n=73)

2.2 IL-35在宮頸癌患者手術前后外周血液中的表達

通過ELISA分別檢測宮頸癌患者手術前后外周血液標本及正常人外周血液標本中IL-35的差異表達，與正常對照組比較，IL-35在手術前后患者血清中的表達升高(P＜0.001)。術后患者血清中的表達(213.79±23.89)pg/mL 較術前(398.71±31.09)pg/mL明顯降低，50例術后復發(fā)和轉移患者血清IL-35的表達(374.25±27.74)pg/mL較23例穩(wěn)定期患者(183.65±34.51)pg/mL 明顯增高(P ＜0.001)，見圖 1。

2.3 宮頸癌患者生存分析

采用Kaplan-Meier法估計患者生存時間，結果發(fā)現(xiàn)高表達IL-35的患者的中位無病生存時間(DFS)為9.115月，較低表達者17.476月明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=36.24，P ＜0.001)。高表達IL-35的患者的總生存時間(OS)為18.031，低表達者為34.254月，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=35.7，P ＜0.001)，見圖2。

本研究同時分析IL-35的表達與患者年齡、疾病分期、組織來源、生存時間、復發(fā)及轉移的關系，結果發(fā)現(xiàn)，IL-35的表達與患者的年齡及組織來源無相關性，差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05);與疾病分期、是否合并HPV感染、是否手術及術后的復發(fā)和轉移密切相關，差異具有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，見表2。

圖1 不同組別患者血清IL-35的表達

圖2 IL-35的表達與宮頸癌患者無進展生存時間(DFS)及總生存時間(OS)的關系

表2 宮頸癌患者血液標本中IL-35的表達與臨床參數(shù)的關系

Cox回歸分析患者的IL-35的表達可作為獨立的預后因子，如表3所示，IL-35高表達的相對危險度為7.083，95%相對危險度的可信區(qū)間為(2.366－21.200)，差異具有統(tǒng)計學意義(W=12.248，P=0.000)，高表達 IL35的患者的總生存時間(HR，0.861;95%CI，0.788 －0.941;P=0.001)和無病生存時間(HR，0.774;95%CI，0.689 －0.870;P=0.000)較低表達者縮短。

表3 Cox回歸分析IL-35的表達與宮頸癌預后的關系

3 討論

IL-35是最近幾年新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，由調節(jié)性T細胞分泌，屬于IL-12細胞因子家族，它的主要功能是抑制效應性T細胞的活性，對免疫系統(tǒng)和免疫反應有負向抑制作用［8，9］。調節(jié)性T細胞是體內存在的一類抑制免疫應答的T細胞亞群，分為天然調節(jié)性T細胞(即CD4+CD25+Treg)和誘導型調節(jié)性T細胞(iTreg)，通過細胞-細胞互相接觸、分泌細胞因子(IL-10、TGF-β1)等途徑抑制B細胞、效應性T細胞的增殖、活化和免疫效應，在抑制自身免疫性疾病發(fā)展、移植耐受、腫瘤免疫逃逸等方面發(fā)揮重要作用。最近發(fā)現(xiàn)，白介素35(IL-35)的產生及功能與Treg密切關系，而且可能為Treg發(fā)揮最大免疫抑制功能所需的關鍵細胞因子。Nicholl等［10］研究發(fā)現(xiàn)IL-35通過增加細胞增殖、抑制細胞凋亡，促進前列腺癌細胞的生長;Pan等［11］研究發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞減少調節(jié)性T細胞的擴增及調節(jié)性T細胞相關IL-35誘導的細胞殺傷作用增加細胞毒性藥物治療白血病的作用;循環(huán)IL-35在胰腺導管腺癌中高表達，尤其是可手術切除的患者中明顯增高［12］;血清IL-35作為評估結直腸癌疾病進展和預后的腫瘤標志物［13］;Wang等［14］研究發(fā)現(xiàn)，IL-35 通過增加髓性細胞的聚集、腫瘤形成，抑制腫瘤免疫反應促進腫瘤細胞的生長;然而，Long等［15］的研究發(fā)現(xiàn) IL-35通過調節(jié)基因相關的細胞周期和凋亡抑制癌癥細胞的活性，抑制其生長，增加腫瘤細胞的凋亡敏感性，此項研究提示IL-35可能作為一個癌基因。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者手術前后血液標本中IL-35的表達高于正常人，而術后患者IL-35的表達較術前明顯降低，但仍高于正常人，差異具有統(tǒng)計學意義。進一步采用Kaplan-Meier法估計患者生存時間，結果發(fā)現(xiàn)高表達IL-35的患者的總生存時間(OS)及無病生存時間(DFS)較低表達者明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學意義。IL-35的表達與患者的年齡及組織來源無相關性，差異無統(tǒng)計學意義，與疾病分期、HPV感染、是否手術及術后是否復發(fā)和轉移密切相關，差異具有統(tǒng)計學意義。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)IL-35可作為獨立的預后因子。以上結果提示IL-35在宮頸癌中也可能作為一種癌基因，影響宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預后。為進一步研究宮頸癌的機制及治療提供一定的理論基礎和臨床指導。

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