王亞軍，李 昆，王德培,2

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

目前對(duì)種子進(jìn)行包衣處理是使種子免受黃曲霉等有害菌侵害的有效手段.迄今為止廣泛使用的種衣劑大部分是化學(xué)農(nóng)藥類種衣劑，該種衣劑在防治有害菌的同時(shí)會(huì)有環(huán)境污染、病害菌抗藥性增加、種子本身殘留農(nóng)藥成分等負(fù)面影響.生物種衣劑是利用拮抗微生物的代謝產(chǎn)物或拮抗微生物本身加工制成的種子包衣劑，它是將拮抗微生物或拮抗物質(zhì)、成膜劑、助劑經(jīng)特定工藝加工制成的，可直接包裹在種子表面，形成具有一定通透性的膜結(jié)構(gòu)[1-2].生物種衣劑因其生物防治功能和零污染成為具有較好發(fā)展前景的一類種衣劑[3].解淀粉芽孢桿菌BI2是本實(shí)驗(yàn)室從秸稈飼料中分離出的一株拮抗菌，其所產(chǎn)的兩種次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)黃曲霉具有較強(qiáng)的抑制作用，其中抑菌物質(zhì)A(已鑒定是表面活性素)對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)有顯著抑制作用，抑菌物質(zhì)B(待鑒定)對(duì)黃曲霉孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)抑制作用[4].另外，其抑菌物質(zhì)對(duì)玉米小斑病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌等20 多種重要的植物病原性菌也具有較強(qiáng)的抑制作用[5].本研究探索BI2除菌發(fā)酵液凍干粉與研發(fā)出的成膜劑混合后作為一種新型種衣劑的可行性.

1 材料與方法

1.1 材料

解淀粉芽孢桿菌BI2(Bacillus amyloliquefaciens BI2)由本實(shí)驗(yàn)室自秸稈飼料中分離得到，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)：CGMCC No.3413；黃曲霉(Aspergillus flavus)由天津科技大學(xué)生化工程研究室保存；花生種子購自天津市康佳益農(nóng)農(nóng)作物種植專業(yè)合作社；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、海藻酸鈉、殼聚糖購自上海紫一試劑廠；聚乙烯醇(PVA)、乙酸、次氯酸鈉購自天津市化學(xué)試劑廠；兩性霉素B 和制霉菌素購自上海生工生物工程有限公司.

1.2 方法

1.2.1 成膜劑配方的篩選

分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1.5%,的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液、1.5%,海藻酸鈉溶液、1.5%,殼聚糖溶液、4%,聚乙烯醇(PVA)溶液.同時(shí)配制復(fù)合型成膜劑溶液，選擇4%,聚乙烯醇與1.5%,羧甲基纖維素鈉分別以體積比3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 的比例混合.根據(jù)其成膜性、透水性、水溶性和溶脹性等指標(biāo)[6]，篩選出最佳成膜劑.每個(gè)處理組3 個(gè)重復(fù).

(1)成膜性測(cè)定：將等體積(1,mL)的各成膜劑溶液于干凈載玻片上流動(dòng)成膜，置于30,℃下晾干.成膜性等級(jí)：Ⅰ級(jí)：能夠均勻成膜，載玻片在水中浸泡30,min 后，膜能從載玻片上完整刮下，表示成膜性好；Ⅱ級(jí)：能夠均勻成膜，載玻片在水中浸泡30,min后，膜不能從載玻片上完整刮下，表示成膜性中等；Ⅲ級(jí)：不能均勻成膜，表示成膜性差.

(2)透水性測(cè)定：將等體積(1,mL)的各成膜劑溶液涂布于圓形濾紙的表面并干燥.取干凈的培養(yǎng)皿蓋稱質(zhì)量，將已干燥的濾紙折疊并放在培養(yǎng)皿蓋上，有成膜劑的一面朝下，吸取10,mL 蒸餾水放在濾紙片內(nèi)，3,h 后稱取培養(yǎng)皿蓋的質(zhì)量，計(jì)算涂抹不同成膜劑的濾紙片滲下水的質(zhì)量.

(3)溶脹性測(cè)定：將等體積(1,mL)的各成膜劑溶液于干凈載玻片上流動(dòng)成膜，干燥后取下稱質(zhì)量，然后浸入水中，6,h 后取出并用濾紙吸去表面的水，再次稱質(zhì)量，按照式(1)計(jì)算溶脹率，其中m 為膜濕質(zhì)量；m0表示膜干質(zhì)量.

(4)水溶性測(cè)定：將等體積(1,mL)的各成膜劑溶液于干凈載玻片上流動(dòng)成膜，干燥后浸入水中，20,h后計(jì)算載玻片上膜溶解的面積，并計(jì)算溶解面積的百分比.

1.2.2 成膜劑溶液的配制及除菌發(fā)酵液凍干粉的特性

發(fā)酵液經(jīng)加熱離心除菌后連續(xù)過 30,000、10,000、5,000 超濾膜后再過400～600 納濾膜，均取透過液，經(jīng)冷凍干燥得到凍干粉.成膜劑按最佳配方進(jìn)行配制，實(shí)驗(yàn)組加入不同質(zhì)量的凍干粉，制成含抑菌物質(zhì)的種子包衣后，包衣種子，對(duì)照組不加抑菌物質(zhì).每個(gè)處理組3 個(gè)重復(fù).

(1)發(fā)酵液凍干粉的pH 穩(wěn)定性：將發(fā)酵液凍干粉溶于水，使其質(zhì)量濃度為100,mg/mL，pH 分別用HCl 和NaOH 調(diào)至5、6、8、10、12，處理12,h 后調(diào)回原pH 8.5，牛津杯法[7]測(cè)定各組的抑菌活性.未經(jīng)處理的發(fā)酵液為對(duì)照，置于30,℃培養(yǎng)36,h，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑.

(2)發(fā)酵液凍干粉的熱穩(wěn)定性：將發(fā)酵液凍干粉溶于水，使其質(zhì)量濃度為100,mg/mL，分別在50、60、70、80、90、100,℃處理 30,min，121,℃處理20,min，牛津杯法測(cè)定各組的抑菌活性.未經(jīng)處理的發(fā)酵液為對(duì)照，置于30,℃培養(yǎng)36,h，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑.

1.2.3 除菌發(fā)酵液凍干粉的最小抑菌質(zhì)量濃度

除菌發(fā)酵液凍干粉的最小抑菌濃度采用96 孔板法[8]測(cè)定.用生理鹽水將PDA 斜面上的黃曲霉孢子洗下.在孔中加入4×106,mL-1的孢子懸液100,μL，然后在孔中分別加入不同質(zhì)量濃度的除菌發(fā)酵液凍干粉溶液各 100,μL，使其終質(zhì)量濃度為 0.38～19.15,mg/mL；陰性對(duì)照為100,μL 無菌水，陽性對(duì)照為50,μg/mL 兩性霉素B，每個(gè)處理組設(shè)3 個(gè)平行.將96 孔板置于30,℃培養(yǎng)48,h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定孔板透光率，孔板透光率沒有變化且孔中無可見黃曲霉孢子萌發(fā)的濃度視為最小抑菌質(zhì)量濃度.

1.2.4 種子包衣方法

稱取形狀規(guī)則、飽滿的花生種子15,g，用1%,次氯酸鈉消毒，并用無菌水洗滌晾干置于250,mL 三角瓶中，吸取成膜劑溶液3,mL，注入三角瓶中并不斷搖動(dòng)，用玻璃棒攪拌種子防止種子粘連，放置30,min，使其在種子表面固化成膜[9].

1.2.5 包衣種子萌發(fā)試驗(yàn)

將包衣后花生種子在40,℃左右的溫水中浸泡2～4,h，取出后放入干凈培養(yǎng)皿中，用6 層紗布蓋好，置于25,℃培養(yǎng)，使其萌發(fā)，每天噴淋等量溫水2 次，保持花生種子濕潤，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子.以同濃度成膜劑包衣的種子和未包衣種子為對(duì)照.發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率按照式(2)、(3)計(jì)算.

1.2.6 種子包衣的抗黃曲霉效果

按照1.2.4 方法，在各個(gè)三角瓶中分別加入含有不同含量抑菌物質(zhì)的成膜劑溶液3,mL，使除菌發(fā)酵液凍干粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1、2、3、4、5,mg/mL，10,mg/mL 的制霉菌素與成膜劑混合后涂布的種子為陽性對(duì)照，未加抑菌物質(zhì)包衣后種子和未包衣種子為空白對(duì)照，再分別在各個(gè)三角瓶中加入2×104,mL-1黃曲霉孢子200,μL，后向各三角瓶中噴灑10,mL PDA 液體培養(yǎng)基，充分搖動(dòng)三角瓶使黃曲霉孢子分散均勻，30,℃培養(yǎng)，觀察黃曲霉生長(zhǎng)情況[10].

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0 中的方差分析程序(ANOVA)分析各實(shí)驗(yàn)部分的差異，在圖中以不同字母表示不同處理組之間具有顯著差異(P＜0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳成膜劑的篩選

實(shí)驗(yàn)表明羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)和海藻酸鈉成膜性較差；聚乙烯醇(PVA)溶脹性較差；殼聚糖具有較好的成膜性、耐水性，但透水性、溶脹性較差.將聚乙烯醇與羧甲基纖維素鈉以一定比例混合后，其溶脹性提高，因此本研究將聚乙烯醇與羧甲基纖維素鈉以不同比例混合，與其他待試成膜劑一起測(cè)定其各種性能指標(biāo).成膜劑的配方：A 為4%,PVA 溶液，B 為1.5%,殼聚糖溶液，C、D、E、F 分別為4%,PVA 與1.5%,CMC-Na 以體積比3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 的混合溶液.在圖中以不同字母表示不同處理組之間具有顯著差異(P＜0.05).

圖1 為成膜劑的透水性測(cè)定結(jié)果.從圖1 中可以看出，配方E 和配方F 的透水性相差不大，但透水性比其他各組效果明顯提高.

圖1 成膜劑的透水性測(cè)定結(jié)果Fig.1 Water permeability of the film former

圖2 為成膜劑的溶脹性測(cè)定結(jié)果.從圖2 中可以看出：配方A 和配方B 的溶脹率不大，其中配方B的溶脹率最低，為70.82%,.復(fù)合型成膜劑的溶脹率均較高，其中配方 C、D、E 的溶脹率分別為188.08%,、180.22%,和175.91%,.

圖2 成膜劑的溶脹率測(cè)定結(jié)果Fig.2 Swelling ratio of the film former

圖3 為成膜劑的水溶性測(cè)定結(jié)果.從圖3 中可以看出：配方A 和配方B 的耐水性非常好.復(fù)合型成膜劑配方C 和配方D 的耐水性較差；配方E 和配方F 的耐水性較好.

圖3 成膜劑的水溶性測(cè)定結(jié)果Fig.3 Water solubility of the film former

從成膜劑的成膜性、透水性、溶脹性和溶水性綜合考慮，配方E(4%,聚乙烯醇與1.5%,羧甲基纖維素鈉以體積比5∶1 混合配制成的成膜劑)綜合性能優(yōu)于其他成膜劑配方，因此選擇其作為種子包衣的最佳成膜劑配方.

2.2 除菌發(fā)酵液凍干粉的特性

除菌發(fā)酵液凍干粉的pH 穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性如圖4 和圖5 所示.從圖4 中可以看出除菌發(fā)酵液凍干粉在酸性條件下不穩(wěn)定，在pH 為6～12 條件下比較穩(wěn)定.

圖4 發(fā)酵液凍干粉的pH穩(wěn)定性Fig.4 The pH stability of the lyophilized powder of the fermentated broth

圖5 發(fā)酵液凍干粉的熱穩(wěn)定性Fig.5 The thermal stability of the lyophilized powder of the fermentated broth

從圖5 中可以看出除菌發(fā)酵液凍干粉在50～90,℃處理30,min，抑菌活性保持不變；在100,℃處理30,min，抑菌活性下降24.4%,；說明其具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性.

2.3 除菌發(fā)酵液凍干粉最小抑菌濃度

發(fā)酵液凍干粉最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示.當(dāng)發(fā)酵液凍干粉質(zhì)量濃度低于1.92,mg/mL 時(shí)，透光率下降，可看到黃曲霉的生長(zhǎng)，且隨著除菌發(fā)酵液凍干粉濃度的降低，黃曲霉的生長(zhǎng)逐漸旺盛；當(dāng)除菌發(fā)酵液凍干粉質(zhì)量濃度高于1.92,mg/mL 時(shí)，無黃曲霉孢子萌發(fā).因此，除菌發(fā)酵液凍干粉對(duì)黃曲霉的最小抑菌質(zhì)量濃度為1.92,mg/mL.

圖6 發(fā)酵液凍干粉的最小抑菌濃度Fig.6 MIC of the lyophilized powder of the fermentated broth

2.4 包衣對(duì)種子萌發(fā)的影響

不同處理方法對(duì)種子萌發(fā)的影響見表1.從表1可以看出，經(jīng)種子包衣后，花生種子在發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率指標(biāo)方面，與對(duì)照組間無顯著差異，說明經(jīng)此成膜劑包衣后不會(huì)影響種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率.

表1 不同處理方法對(duì)種子萌發(fā)的影響Tab.1 The effect of the different treatment on seed germination

2.5 種子包衣的抗黃曲霉效果

種子包衣的抗黃曲霉效果如圖7 所示.從圖7中可見：黃曲霉在沒有任何抑菌物質(zhì)存在時(shí)生長(zhǎng)旺盛(圖7,G、H)；在有較低質(zhì)量濃度抑菌物質(zhì)存在時(shí)，黃曲霉生長(zhǎng)受到一定抑制；隨著除菌發(fā)酵液凍干粉在成膜劑溶液中質(zhì)量濃度的增加，黃曲霉的生長(zhǎng)量逐漸減少，當(dāng)除菌發(fā)酵液凍干粉質(zhì)量濃度達(dá)到4,mg/mL(圖7,D)時(shí)，沒有黃曲霉生長(zhǎng)，與制霉菌素溶液包衣種子的抑菌效果相近.

圖7 種子包衣抑制黃曲霉的效果Fig.7 The inhibitory effect of seed coating on Aspergillus flavus

3 討論

芽孢桿菌BI2是一株廣譜拮抗菌株，能夠抑制20多種植物病原菌[12]，本研究期望利用芽孢桿菌BI2發(fā)酵液中具有高效抑菌能力的抑菌物質(zhì)，旨在開發(fā)一種新型環(huán)保生物種衣劑，實(shí)現(xiàn)防止種子霉變的目的.與化學(xué)農(nóng)藥種衣劑相比，微生物種衣劑尤其是在其次級(jí)代謝產(chǎn)物作為有效成分時(shí)，對(duì)包衣后的成膜性等要求很高[13].經(jīng)過成膜劑配方的配制實(shí)驗(yàn)，最終選擇4%,聚乙烯醇與1.5%,羧甲基纖維素鈉以體積比5∶1 混合配制成的成膜劑作為種子包衣的最佳成膜劑配方，以此比例混合配制成的成膜劑，綜合性能優(yōu)于其他成膜劑配方，并且對(duì)包衣后花生種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率沒有顯著影響.含有抑菌物質(zhì)的發(fā)酵液凍干粉pH 穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性均較好，可適用于種子包衣中.在抑制黃曲霉孢子萌發(fā)方面，抑制黃曲霉孢子萌發(fā)的最小質(zhì)量濃度為1.92,mg/mL.在抑制花生種子表面的黃曲霉時(shí)，隨著發(fā)酵液凍干粉質(zhì)量濃度的增加，黃曲霉的生長(zhǎng)量逐漸減少，成膜劑中最小發(fā)酵液凍干粉的含量只有4,mg/mL.目前用芽孢桿菌菌劑包衣種子防治植物病害菌方面的報(bào)道仍較少，一種新型環(huán)保生物種衣劑需要考慮多方面的因素，比如殺菌效能、對(duì)人體的危害性、殘留量等.吳繼星等[14]以蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)為活性成分研制出一種生物種衣劑，不僅能防治大豆孢囊線蟲病且能促進(jìn)大豆生長(zhǎng).李春等[15]利用根瘤菌、固氮菌等有益微生物作為活性成分，研制出一種能防治棉花苗期病害、促進(jìn)棉花生長(zhǎng)及增強(qiáng)棉花在鹽脅迫下生長(zhǎng)能力的多功能生物種衣劑.本研究中芽孢桿菌種衣劑的活性成分自菌體發(fā)酵產(chǎn)生，與化學(xué)農(nóng)藥類種衣劑相比具有易于生產(chǎn)、成本低、環(huán)保無毒等優(yōu)點(diǎn).本研究研制的新型種衣劑為菌株和生防制劑的進(jìn)一步研究和發(fā)展提供了優(yōu)良的資源，有望在種子及生防領(lǐng)域得到應(yīng)用.

［1］Ziani K，Ursúa B，Maté J I.Application of bioactive coatings based on chitosan for artichoke seed protection[J].Crop Protection，2010，29(8)：853-859.

［2］Hirano S，Yamamoto T，Hayashi M，et al.Chitinase activity in seeds coated with chitosan derivatives[J].Agricultural and Biological Chemistry，1990，54(10)：2719-2720.

［3］張琦，徐寧彤，曲琪環(huán).生物復(fù)合型種衣劑對(duì)香谷苗期生理指標(biāo)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(30)：16746-16747，16750.

［4］王德培，李可樂，王亞軍，等.解淀粉芽孢桿菌BI2抗真菌活性物質(zhì)的分離純化及特性分析[J].食品工業(yè)科技，2013(11)：78-81.

［5］孟慧.芽孢桿菌BI2的鑒定及其抑制黃曲霉特性的研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2011.

［6］楊樺.種衣劑在林木種子上應(yīng)用及殼聚糖作為種衣劑抗性添加劑的研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［7］劉冬梅，李理，楊曉泉，等.用牛津杯法測(cè)定益生菌的抑菌活力[J].食品研究與開發(fā)，2006，27(3)：110-111.

［8］胡小平，喆萬，李若瑜.應(yīng)用CLSI M38-A2 方案測(cè)定須癬毛癬菌對(duì)抗真菌藥物敏感性[J].中國真菌學(xué)雜志，2011，6(3)：149-153.

［9］董麗萍，浦恩堂，吳毅歆，等.解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2 復(fù)方油菜種衣劑的研制[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，35(4)：558-564.

［10］Zhang Ting，Shi Zhiqi，Hu Liangbin，et al.Antifungal compounds from Bacillus subtilis B-FS06 inhibiting the growth of Aspergillus flavus[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24(6)：783-788.

［11］肖琴.新型環(huán)保型棉花種衣劑的研制與應(yīng)用研究[D].武漢：武漢理工大學(xué)，2008.

［12］王德培，孟慧，管敘龍，等.解淀粉芽孢桿菌BI2的鑒定及其對(duì)黃曲霉的抑制作用[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，25(6)：5-9.

［13］姚麗霞，武占省，李春.一種復(fù)合型成膜劑的成膜性能測(cè)定及其對(duì)生防菌抑菌活性的影響[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11(3)：381-387.

［14］吳繼星，陳在佴，曹春霞，等.蘇云金桿菌懸浮種衣劑：中國，1849890A[P].2006-04-06.

［15］李春，姚麗霞，陶晶，等.一種多功能生物種衣劑及制備方法：中國，101444227A[P].2009-01-09.