鄭 潔 ，何海榮，王寧麗，裴 棟，田亞濤，謝雪健，劉曄瑋*

蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究;2 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 中科院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室，蘭州 730000

油橄欖(Olea europaeaL.)屬木樨科(Europaea)木樨欖屬(Olea)植物，是世界著名的常綠木本油料和果用樹種［1］。流行病學(xué)［2，3］和動物實驗［4］都證明了橄欖油具有降低心血管疾病、胃癌、乳腺癌等疾病發(fā)病率的潛在作用，這種作用不僅歸因于橄欖油中不飽和脂肪酸和維生素等生物活性物質(zhì)，還與其中具有抗氧化活性的酚類化合物有關(guān)［5］，而油橄欖葉中的抗氧化活性物質(zhì)含量高于油橄欖果、莖和樹皮［6］。

目前，關(guān)于油橄欖葉提取物的分離純化［7，8］及抗癌［9，10］、降血壓［11］、降血糖［12］等各種生理活性及體外抗氧化活性的研究較多，Coban［13］等研究了油橄欖葉提取物的體內(nèi)抗氧化活性，但對其抗氧化活性的系統(tǒng)研究鮮見報道。本文通過觀察小鼠體內(nèi)抗氧化指標(biāo)和組織形態(tài)學(xué)的變化，結(jié)合體外清除DPPH·和·OH 的能力，系統(tǒng)研究了油橄欖葉提取物的抗氧化作用，為充分利用目前被廢棄的油橄欖葉，開發(fā)具有保健功能的油橄欖多酚產(chǎn)品，延長產(chǎn)業(yè)鏈，實現(xiàn)種植和精深加工多形式的優(yōu)化組合提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試樣品

油橄欖葉提取物(隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司提供，課題組經(jīng)HPLC 法測定橄欖苦苷含量為22.3%);橄欖苦苷(購自青島耐特生物技術(shù)有限公司，課題組經(jīng)HPLC 法測定其含量為98.2%)。

1.1.2 主要試劑與儀器

試劑:D-半乳糖(D-gal)、Coomassie Brilliant Blue G-250、Albumin Bovine V(Sigma，美國);維生素E(VE)(江西天之海藥業(yè)股份有限公司);1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)標(biāo)準(zhǔn)品(批號S43654-098，Sigma，美國);抗壞血酸對照品(批號:A-4544，購自Fluka 公司，美國);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號:20140312，南京建成生物工程研究所);其它試劑均為分析純，水為實驗室自制雙蒸水。

儀器:旋渦混合器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠);L600 臺式低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);Microfuge?22R Centrifuge(美國貝克曼庫爾特/Beckman Coulter);UV759 紫外-可見分光光度計(上海精密儀器科技有限責(zé)任公司)。

1.1.3 實驗動物

25 g 左右雄性健康成年昆明種小鼠90 只，購于蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心(動物合格證號:甘醫(yī)動字第14-006);飼養(yǎng)條件:溫度18～22 ℃，光暗周期12 h:12 h，群養(yǎng)，3 只/籠，常規(guī)喂養(yǎng)飼料，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 體外清除自由基作用

參照文獻(xiàn)［14，15］方法及預(yù)實驗結(jié)果，以抗壞血酸、橄欖苦苷為對照，測定各質(zhì)量濃度的油橄欖葉提取物對DPPH·和·OH 的清除率，分別計算其半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.2 D-gal 致衰老小鼠抗氧化作用

1.2.2.1 動物分組及給藥劑量設(shè)置［16］

小鼠按體重隨機分為6 組，即:空白組、D-gal 模型組、油橄欖葉提取物低、中、高劑量組、VE 組。油橄欖葉提取物組給藥量分別為58、116、232 mg/kg BW;VE 組VE 灌胃100 mg/kg BW;空白組與D-gal模型組灌胃等量生理鹽水。除空白組外，其余各組均每日頸背部皮下注射D-gal 200 mg/kg BW，注射量為0.1 mL/10 g，空白組每日皮下注射等量生理鹽水。每3 d 稱體重和食物，換算灌胃量并計算食物利用率。D-gal 與油橄欖多酚均連續(xù)給藥30 d。

1.2.2.2 體內(nèi)抗氧化指標(biāo)測定

各組于實驗?zāi)┤战?6 h 后摘眼球采血，離心取血清-80 ℃保存?zhèn)溆?，同時迅速取出小鼠腦、肝組織做成10%勻漿，離心取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明操作，測定血清、肝組織、腦組織中MDA 含量、SOD 和GSH-Px 活性;蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.2.2.3 小鼠肝臟和大腦組織形態(tài)學(xué)觀察

取部分肝臟和大腦組織，制成HE 染色切，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、多重比較和直線回歸分析。以P＜0.05 為結(jié)果差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，以P＜0.01 為更有理由相信結(jié)果差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 體外清除自由基作用

各質(zhì)量濃度的油橄欖葉提取物對DPPH·和·OH均有一定的清除作用，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖1、2)?？箟难?、橄欖苦苷和油橄欖葉提取物對DPPH·和·OH 的IC50分別為0.016、0.058、0.064 mg/mL;0.052、0.046、0.066 mg/mL。

圖1 油橄欖葉提取物清除DPPH·的活性Fig.1 DPPH· scavenging activities of O.europare leaf extracts

圖2 油橄欖葉提取物清除·OH 的活性Fig.2 ·OH scavenging activities of O.europare leaf extracts

2.2 小鼠血清、肝臟組織、大腦組織的MDA 含量、SOD 和GSH-Px 酶活性測定結(jié)果

各組血清、肝臟組織的SOD、GSH-Px 活性和大腦組織的SOD 活性與D-gal 模型組比較都有所增加(表1～3)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;各組血清、肝臟組織以及高劑量組大腦組織的MDA 水平的與D-gal模型組比較都有所降低(表1～3)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。說明衰老模型建立成功。與空白組相比，各組高劑量組的GSH-Px 活性明顯升高(表1、2)，SOD活性明顯升高(表1～3)，MDA 含量明顯降低(表1～3)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明油橄欖葉提取物能顯著提高體內(nèi)抗氧化酶活力。

2.3 小鼠肝臟和大腦組織形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

D-gal 模型組肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞彌漫水腫，界限不清，胞漿疏松化或呈空泡樣變，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列不整齊，可見點狀壞死，肝血竇變狹窄，血管外周間隙增大(圖3B)。油橄欖葉提取物低、中、高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞索排列、肝細(xì)胞水腫、細(xì)胞增生程度與D-gal 模型組相比，逐步恢復(fù)，并隨油橄欖葉提取物劑量的增加，恢復(fù)程度也逐漸增加(圖3 C、D、E);VE 組肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，肝細(xì)胞索排列規(guī)則，細(xì)胞輕度增生(圖3F)。

表1 油橄欖葉提取物對血清MDA、SOD、GSH-Px 的影響(±s，n=15)Table 1 Effect of O.europaea leaf extracts on serum MDA，SOD，GSH-Px levels (±s，n=15)

表1 油橄欖葉提取物對血清MDA、SOD、GSH-Px 的影響(±s，n=15)Table 1 Effect of O.europaea leaf extracts on serum MDA，SOD，GSH-Px levels (±s，n=15)

注:與D-gal 模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與空白組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note:Compared with the D-gal model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;compared with the control group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

表2 油橄欖葉提取物對肝組織MDA、SOD、GSH-Px 的影響(±s，n=15)Table 2 Effect of O.europaea leaf extracts on liver tissue MDA，SOD，GSH-Px levels(±s，n=15)

表2 油橄欖葉提取物對肝組織MDA、SOD、GSH-Px 的影響(±s，n=15)Table 2 Effect of O.europaea leaf extracts on liver tissue MDA，SOD，GSH-Px levels(±s，n=15)

注:與D-gal 模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與空白組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note:Compared with the D-gal model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;compared with the control group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

表3 油橄欖葉提取物對腦組織的MDA、SOD 的影響(±s，n=15)Table 3 Effect of O.europaea leaf extracts on brain tissue MDA and SOD levels(±s，n=15)

表3 油橄欖葉提取物對腦組織的MDA、SOD 的影響(±s，n=15)Table 3 Effect of O.europaea leaf extracts on brain tissue MDA and SOD levels(±s，n=15)

注:與D-gal 模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與空白組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note:Compared with the D-gal model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;compared with the control group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

圖3 空白組(A)、D-gal 模型組(B)、低劑量組(C)、中劑量組(D)、高劑量組(E)及VE 組(F)肝臟組織HE染色照片(10 ×40)Fig.3 HE staining images of liver tissues from blank (A)，D-gal model (B)，low-dose (C)，middle-dose (D)，high-dose (E)and VE groups (10 ×40)

2.3.2 大腦組織形態(tài)學(xué)觀察

2.3.2.1 小鼠大腦皮層形態(tài)學(xué)觀察

D-gal 模型組神經(jīng)元細(xì)胞排列稀疏紊亂，椎體細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞脫失明顯，甚至僅見少量殘存的不規(guī)則細(xì)胞，并出現(xiàn)細(xì)胞核溶解，細(xì)胞輪廓不清晰，胞漿疏松，并有炎性細(xì)胞浸潤(圖4B)。油橄欖葉提取物低、中、高劑量組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞核多是中間位，可見少量細(xì)胞固縮，并隨著油橄欖葉提取物劑量的增大，恢復(fù)程度逐漸增加(圖4 C，D，E)。VE組神經(jīng)元細(xì)胞基本恢復(fù)，數(shù)量較多，形態(tài)基本正常，細(xì)胞核多是中間位，可見少量細(xì)胞固縮(圖4 F)。

2.3.2.2 小鼠大腦海馬結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察

圖4 空白組(A)、D-gal 模型組(B)、低劑量組(C)、中劑量組(D)、高劑量組(E)及VE 組(F)大腦皮層HE染色照片(10 ×40)Fig.4 HE staining images of cerebral cortex from blank(A)，D-gal model (B)，low-dose (C)，middle-dose(D)，high-dose (E)and VE groups (10 ×40)

D-gal 模型組小鼠海馬錐體細(xì)胞排列稀疏紊亂，細(xì)胞脫失明顯，甚至僅見少量殘存的不規(guī)則細(xì)胞，較多神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮、溶解，細(xì)胞間隙擴大，排列松散，細(xì)胞輪廓不清晰，胞質(zhì)染色呈深紅色(圖5B)。油橄欖葉提取物低、中、高劑量小鼠海馬齒狀回區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整，細(xì)胞形態(tài)良好，無明顯變性細(xì)胞，并隨著油橄欖葉提取物劑量的增大，恢復(fù)程度逐漸增加(圖5 C、D、E)。VE 組小鼠大腦海馬齒狀回區(qū)基本恢復(fù)，錐體細(xì)胞排列整齊、緊密，層次豐富，形態(tài)正常，無變性，核大而圓，細(xì)胞質(zhì)豐富(圖5F)。

圖5 空白組(A)、D-gal 模型組(B)、低劑量組(C)、中劑量組(D)、高劑量組(E)及VE 組(F)海馬結(jié)構(gòu)HE染色照片(10 ×40)Fig.5 HE staining images of hippocampal structure from blank (A)，D-gal model (B)，low-dose (C)，middle-dose (D)，high-dose (E)and VE groups (10 ×40)

3 討論

3.1 油橄欖葉提取物的抗氧化作用

體外實驗結(jié)果表明，油橄欖葉提取物能有效地清除DPPH·和·OH。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，油橄欖葉提取物能降低小鼠血清、肝臟和腦組織中的MDA含量，增加小鼠血清和肝臟組織中SOD 和GSH-Px的活性，增加小鼠腦組織中SOD 的活性，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，提示油橄欖葉提取物可能通過提高機體抗氧化酶的活性達(dá)到清除自由基的目的，從而增強了機體的抗氧化能力。體內(nèi)、體外及病理形態(tài)學(xué)的結(jié)果都說明油橄欖葉提取物具有較好的抗氧化活性。

3.2 油橄欖葉提取物各成分間的抗氧化協(xié)同作用

油橄欖葉提取物除含有22.3%的橄欖苦苷，還有木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和羥基酪醇醋酸酯［17］等多種抗氧化活性成分。Benavente［18］等研究報道，油橄欖葉提取物的Trolox當(dāng)量抗氧化能力(TEAC)值比理論上提取物中其他酚類活性物質(zhì)相加的平均TEAC 值高出72%，表明油橄欖多酚清除自由基能力具有協(xié)同作用;Mylonaki［19］等對油橄欖葉提取物的總多酚和其抗自由基活性值之間做了簡單線性回歸分析，結(jié)果顯示了低的相關(guān)性，無統(tǒng)計學(xué)差異(R2=0.273，P＞0.05)，這表明它不是純粹的多酚類物質(zhì)提供高抗氧化能力，相反，這種效力可能是通過各種酚類成分之間的相互作用。因此，提示油橄欖葉提取物的抗氧化能力可能呈協(xié)同作用，即油橄欖葉提取物中的多種抗氧化活性成分共同協(xié)作，在機體內(nèi)發(fā)揮較強的抗氧化功能。根據(jù)以上研究結(jié)果，本實驗中油橄欖葉提取物對衰老小鼠的抗氧化作用通過多種抗氧化成分共同作用，因而抗氧化能力較強。建議在今后對油橄欖葉的進(jìn)一步加工和應(yīng)用時，保留油橄欖葉提取物多種活性成分。

綜上所述，油橄欖葉提取物具有較好的抗氧化功能，其機制與清除體內(nèi)自由基，增加體內(nèi)抗氧化酶活性有關(guān)。本實驗對油橄欖葉提取物抗氧化功能的研究，為深入研究其抗氧化機制提供理論基礎(chǔ)，為天然藥物和保健食品的研究和開發(fā)提供理論和臨床依據(jù)。

1 Han HB(韓華柏)，He F(何方).The olive introduction of research progress in our country.South China Fruits(中國南方果樹)，2007，36(3):37-42.

2 Verberne L，Bach-Faig A，Buckland G，et al.Association between the mediterranean diet and cancer risk:a review of observational studies.Nutr Cancer，2010，62:860-870.

3 Trichopoulou A，Costacou T，Bamia C，et al.Adherence to a Mediterranean diet and survival in a Greek population.New Eng J Med，2003，348:2599-2608.

4 Paiva-Martins F，F(xiàn)ernandes J，Rocha S，et al.Effects of olive oil polyphenols on erythrocyte oxidative damage.Mole Nutr Food Res，2009，53:609-616.

5 Blekas G，Vassilakis C，Harizanis C，et al.Biophenols in table olives.J Agric Food Chem，2002，50:3688-3692.

6 Wang CZ(王成章)，Gao CX(高彩霞)，Jiang CY(姜成英).Chemical composition and processing of olive.China Forest Sci Technol(林業(yè)科技開發(fā))，2006，20(2):1-4.

7 Bianco A，Uccella N.Biophenolic components of olives.Food Res Int，2000，33:475-485.

8 Tasioula-Margari M，Okogeri O.Isolation and characterization of virgin olive oil phenolic compounds by HPLC/UV and GCMS.J Food Sci，2001，66:530-534.

9 Bulotta S，Corradino R，Celano M，et al.Antioxidant and antigrowth action of peracetylated oleuropein in thyroid cancer cells.J Mol Endocrinol，2013，51:181-189.

10 Samet I，Han J，Jlaiel L，et al.Olive (Olea europaea)leaf extract induces apoptosis and monocyte/macrophage differentiation in human chronic myelogenous leukemia K562 cells:insight into the underlying mechanism.Oxid Med Cell Longev，2014，2014:927619.

11 Khayyal MT，El-ghazaly MA，Abdallah DM，et al.Blood pressure lowering effect of an olive leaf extract (Olea europaea)in L-Name induced hypertension in rats.Arzneimittelforschung，2002，52:797-802.

12 Al-Azzawie HF，Alhamdani M-S S.Hypoglycemic and antioxidant effect of oleuropein in alloxan-diabetic rabbits.Life Sci，2006，78:1371-1377.

13 Coban J，?ztezcan S，Do?ru-Abbaso?lu S，et al.Olive leaf extract decreases age-induced oxidative stress in major organs of aged rats.Geriatr Gerontol Int，2014，14:996-1002.

14 Xu YM(徐月敏)，Liu Y(劉毅)，Liu YF(劉永峰)，et al.Study on activities for scavenging free radicals of deer blood oligopeptides.Food Ind(食品工業(yè))，2014，35:172-175.

15 Bu LN(卜令娜)，Zhang J(張佳)，Xu YM(徐月敏)，et al.Screening of active fractions about scavenging free radicals fromOleaeuropaeaL.leaves.Food Ind(食品工業(yè))，2013，34:131-133.

16 State Food and Drug Administration(國家食品藥品監(jiān)督管理局).Antioxidant function evaluation method.http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0847/71257.html，2012-04-23.

17 Wang XF(王曉飛)，Li C(李辰)，Zheng YY(鄭媛媛)，etal.Polyphenols from leaves ofOlea europaea.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2011，42:848-851.

18 Benavente-Garcia O，Castillo J，Lorente J，et al.Antioxidant activity of phenolics extracted fromOlea europaeaL.leaves.Food Chem，2000，68:457-462.

19 Mylonaki S，Kiassos E，Makris D P，et al.Optimisation of the extraction of olive (Olea europaea)leaf phenolics using water/ethanol-based solvent systems and response surface methodology.Anal Bioanal Chem，2008，392:977-985.