趙茜茜，劉俊義，王 珂，鄧 紅，張志宇

陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710062

文冠果(Xanthoceras sorbifoliabunge)又名文燈果，為無患子科文冠果屬木本植物，在我國北方地區(qū)尤其西北地區(qū)分布廣泛［1，2］。文冠果種仁既可食用，也可榨油，其種仁含油率高達(dá)55%～65%，是我國特有的油料樹種［3］。

近年的研究［4，5］表明，文冠果的果實、根莖等部位均含有大量的生物活性的成分，主要是甾醇、皂苷、植物堿等，這些活性成分經(jīng)提取純化后，可應(yīng)用于抗炎、改善記憶、防治心血管疾病、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等多種藥物中，具有非常好的應(yīng)用前景和實用價值。

甾醇是一類主要存在于動植物及菌類細(xì)胞與組織中的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物活性成分，按其來源則可分為動物甾醇、植物甾醇和菌類甾醇三類［6］。植物甾醇廣泛存在于植物的細(xì)胞組織中，尤其在各種堅果和植物種子中含量較多，其中谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等比較常見。植物甾醇結(jié)構(gòu)與動物膽甾醇的結(jié)構(gòu)十分相似，具有免疫調(diào)節(jié)、消炎退熱、抗氧化、降血脂、清除自由基及延緩衰老等多種生理功效，在醫(yī)藥、食品和化妝品及飼料等行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用［7-9］。

現(xiàn)有文獻(xiàn)［10，11］中關(guān)于植物甾醇的研究大多數(shù)都是針對玉米、菜籽及豆油下腳料等方面，對文冠果種仁甾醇的相關(guān)研究非常少見，除了本課題組做的文冠果甾醇提取及抑菌效果的初步試驗外［12］，對文冠果種仁油中甾醇的種類、單體含量以及功效都不甚清楚。

本課題為提高提取效率，在實驗室前期工作的基礎(chǔ)上優(yōu)選了萃取溶劑，以豆甾醇為標(biāo)準(zhǔn)品，通過單因素和正交試驗考查了皂化法提取文冠果種仁油中甾醇的主要影響因素，探討最佳工藝條件;進(jìn)而用溶劑結(jié)晶法對甾醇粗提物進(jìn)行精制，利用氣相色譜儀分析了精制前后甾醇含量的變化;最終通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)檢測確定了文冠果種仁油中甾醇的種類及結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步探討文冠果種仁甾醇的生物活性及抑菌效果量效與構(gòu)效關(guān)系等打下基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料與試劑

原材料:文冠果種子(即文冠果籽，本校生科院種質(zhì)資源專家已鑒定)，購于陜西省楊凌金山農(nóng)業(yè)科技有限公司，該公司專業(yè)進(jìn)行文冠果育種育苗工作。

試劑:石油醚、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、氫氧化鉀等均為分析純，購于西安森博化玻儀器供應(yīng)站。膽固醇為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇(標(biāo)準(zhǔn)品)均為色譜純，購于Sigma 公司。

1.2 主要儀器與試驗設(shè)備

JA2003 型電子天平，上海精科天平有限公司;2010 Ultra 型氣質(zhì)聯(lián)用儀——單四極桿，日本島津;KQ-200KDE 型高功率數(shù)顯超聲波清洗器，昆山市超生儀器有限公司;722 型紫外可見分光光度計，上海市光譜儀器有限公司;RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHB-III 型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

2 實驗方法

2.1 總甾醇的提取及其含量分析

2.1.1 文冠果種仁油中總甾醇的皂化法提取步驟

將文冠果籽人工破殼，取種仁粉碎;用石油醚按1∶10(g/mL)的料液比，在60 ℃下加熱回流提取油脂3 次，提取液真空抽濾后，得到文冠果種仁油。每次稱取一定量文冠果種仁油于圓底燒瓶中，加入KOH-乙醇溶液，水浴上回流加熱120 min;取下圓底燒瓶加蒸餾水稀釋，冷卻備用。取200 mL 皂化液，后移入分液漏斗，加入適量的乙酸乙酯萃取，緩慢振動幾分鐘靜置分層，去掉乙酸乙酯不溶物，連續(xù)萃取3～4 次，合并乙酸乙酯萃取液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾濃縮提取物，回收所有乙酸乙酯。

2.1.2 總甾醇的測定

以豆甾醇為標(biāo)準(zhǔn)品，采用分光光度法測定取提取液中總甾醇的含量。

2.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)豆甾醇溶液的配制:精密稱取豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品20 mg 溶于20 mL 三氯甲烷中，不溶時超聲數(shù)秒促其溶解，搖勻，即得1.0 mg/mL 豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，于棕色瓶中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

顯色劑的配制:將1 mL 濃硫酸沿壁緩慢加入到20 mL 乙酸酐溶液中，搖勻，冷卻備用。

用移液管精密移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于6 個5 mL 具塞比色管中，分別加入酸試劑2.0 mL，以CHCl3定容，搖勻，超聲分散1 min，靜置10 min 后，以試劑空白為參比在675 nm 處測量吸光度，每個點(diǎn)重復(fù)3 次。以各試管豆甾醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線該曲線的回歸方程為y=5.3396x+0.0231，相關(guān)系數(shù)R2=0.9948，說明曲線回歸性很好，可進(jìn)行定量分析。

2.1.2.2 樣品液中總甾醇的測定

按同樣的方法處理不同條件下的皂化提取液1 mL 于5 mL 具塞試管中，加入酸試劑2 mL，用三氯甲烷定容至刻度，超聲分散1 min，靜置10 min，于675 nm 處測定其吸光度A，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的總甾醇質(zhì)量濃度，以考察各因素對甾醇含量的影響。

2.2 總甾醇的皂化法提取試驗設(shè)計

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［13，14］和預(yù)試驗結(jié)果，根據(jù)2.1.1的方法，以文冠果種仁油中總甾醇含量為試驗?zāi)繕?biāo)，分別在不同的皂化時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)、溶劑用量(100、150、200、250、300 mL)、皂化溫度(62、67、72、77、82 ℃)、料液比［1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 (mL/g oil)］下進(jìn)行單因素試驗以考察各因素對總甾醇含量的影響;在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用L9(34)正交實驗確定最佳提取工藝條件，正交實驗的因素水平表見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Levels and factors of orthogonal test

2.3 文冠果種仁油中粗甾醇的純化

采用重結(jié)晶法［15］進(jìn)行純化:將實驗獲得的甾醇粗提物溶于60 ℃的無水乙醇中，充分溶解，自然降溫至室溫后于0 ℃降溫結(jié)晶12～18 h;快速過濾得濾渣，并用一定量的乙醇沖洗濾渣表面，將所得濾渣干燥即可得到較純的甾醇樣品。將較純化的甾醇樣品再溶于60 ℃的正己烷中并充分溶解，自然降溫至室溫后于0 ℃降溫結(jié)晶12～18 h。快速過濾得濾渣，并用一定量的正己烷沖洗濾渣表面，將所得濾渣干燥即可得到純化的甾醇物質(zhì)。

經(jīng)多次試驗確定了較好的純化條件:料液比為1∶5(g/mL)，結(jié)晶溫度60 ℃，結(jié)晶時間12 h。

2.4 文冠果種仁總甾醇的純度及其組成分析

2.4.1 甾醇的定性與定量分析

采用GC-FID 法對皂化提取物-甾醇進(jìn)行定性與定量分析，分析儀器為日本島津氣相色譜儀GC-2010，色譜柱DB-1TH (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)。檢測條件:載氣為高純氮?dú)?總流量為35 mL/min，分流比30;柱流量為0.89 mL/min;進(jìn)樣口和FID 檢測器溫度都設(shè)定為300 ℃;柱溫270 ℃。以膽固醇為內(nèi)標(biāo)物計算其甾醇的純度。

2.4.1.1 甾醇的定性分析［16］

利用已知物(膽固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇)直接對照法進(jìn)行定性，即將未知物和已知標(biāo)準(zhǔn)物在同一根色譜柱上，使用相同的色譜操作條件進(jìn)行分析，作出色譜圖后進(jìn)行對照比較，根據(jù)保留時間進(jìn)行定性。

2.4.1.2 甾醇的定量分析

采用膽固醇作為內(nèi)標(biāo)物，對樣品中的植物甾醇組分進(jìn)行定量分析［17］。

(a)校正系數(shù)f1的計算

式中:f1—校正系數(shù)，A內(nèi)—內(nèi)標(biāo)峰峰面積，A標(biāo)—標(biāo)準(zhǔn)品峰峰面積，C內(nèi)—內(nèi)標(biāo)溶液內(nèi)標(biāo)物濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL)，m標(biāo)—配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液時豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的取用量，單位為毫克(mg)，P內(nèi)—內(nèi)標(biāo)膽固醇的純度，P標(biāo)—標(biāo)準(zhǔn)品豆甾醇的純度。

(b)甾醇樣品中游離甾醇酯的含量

式(1)中:A甾醇酯1—待測甾醇酯樣品中植物甾醇峰峰面積之和，m甾醇酯1—配制待測溶液C 時甾醇酯的取用量，單位為毫克(mg);P游離甾醇—甾醇酯樣品中游離甾醇酯的含量(%)。

2.4.2 總甾醇的組成及其結(jié)構(gòu)分析

氣相色譜條件:毛細(xì)管色譜柱:Rxi-SSLMS-1(30 m×250 μm，0.25 μm);進(jìn)樣口溫度300 ℃;載氣為高純度氦氣，載氣流速0.86 mL/min;分流比30，進(jìn)樣量1.0 μL。

質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;離子源溫度220 ℃;接口溫度300 ℃;全掃描方式。

3 結(jié)果與討論

3.1 文冠果種仁油中總甾醇的皂化法提取的單因素試驗結(jié)果

皂化時間、萃取溶劑用量、料液比、皂化溫度對文冠果種仁中總甾醇提取率的影響分別見圖1(A～D)。

由圖1 可以看出，甾醇提取率隨著皂化時間、文冠果種仁油和KOH-乙醇的料液比、溫度的增加都呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，而乙酸乙酯用量越大提取率越高;但綜合考慮提取率、成本、對環(huán)境的污染等各種因素，選擇皂化時間1.5、2、2.5 h，萃取溶劑用量150、200、250 mL，料液比1∶3、1∶4、1∶5 g/mL、皂化溫度67、72、77 ℃再進(jìn)行正交實驗。

圖1 皂化時間(A)、乙酸乙酯用量(B)、料液比(C)及 皂化溫度(D)對提取液中甾醇含量的影響Fig.1 The effect of saponification time (A)，volume of ethyl acetate (B)，solid to liquid ratio (C)and saponification temperature(D)on the extraction yield of sterol

3.2 皂化法提取總甾醇的正交實驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以皂化時間、溶劑用量、皂化溫度、料液比的選擇對甾醇提取率的影響，采用L9(34)正交實驗對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗結(jié)果與級差分析如下表2 所示，方差分析見表3。

由L9(34)正交試驗結(jié)果的極差分析可得:影響提取文冠果總皂苷含量的因素依次為乙酸乙酯用量(D)＞皂化時間(B)＞料液比(A)＞提取溫度(C)。極差分析確定的最佳皂化提取條件為:A3B2C2D2，即料液比為1∶5(g/mL)、皂化時間為2 h、皂化溫度為72 ℃，乙酸乙酯用量為200 mL;此條件不在上述正交表里，進(jìn)行驗證實驗，可知最佳皂化提取條件下文冠果總皂苷含量為0.498%。

根據(jù)方差分析結(jié)果可知，四個因素的作用均高度顯著，各因素對實驗指標(biāo)影響的主次順序為乙酸乙酯用量(D)＞皂化時間(B)＞料液比(A)＞提取溫度(C)，這與極差分析結(jié)果一致。

3.3 氣相色譜分析結(jié)果

3.3.1 甾醇的定性分析

用各甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，在2.4.1 擬定的色譜條件下得到各標(biāo)準(zhǔn)甾醇的色譜圖見圖2(A);純化前后試驗所得樣品的色譜圖見圖2(B)和2(C)。粗品僅有三個檢出峰，純化之后檢測出了粗品未能有效分離的成分，共有7 個峰，且響應(yīng)值大;通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間值進(jìn)行對比，確定文冠果種仁油中皂化提取物中含有豆甾醇和β-谷甾醇。

表2 總甾醇提取條件正交試驗結(jié)果與級差分析Table 2 The results and range analysis of orthogonal test for the extraction of total sterols

表3 總甾醇提取條件正交試驗的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA of orthogonal test results for the extraction of sterol

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品(A)及純化前(B)、后(C)樣品的GC-FID 色譜圖Fig.2 GC-FID chromatograms of mixed phytosterol standards (A)and sample before (B)，after (C)purification

3.3.2 甾醇的定量分析

按照2.4.1 擬定的色譜條件進(jìn)行檢測，并根據(jù)公式(1)計算，可得純化前文冠果種仁油中皂化提取物總甾醇含量為14%，純化后總甾醇含量為55%。甾醇純度顯著提高，說明重結(jié)晶技術(shù)手段在甾醇的純化中效果良好。

3.4 總甾醇組成的氣質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果

根據(jù)GC-MS 的數(shù)據(jù)以及文獻(xiàn)記載的甾醇的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合GC-FID 的分析譜，從總離子流中的7個峰中最終確認(rèn)了5 個峰的分子組成，按照其出峰的順序分別為:1、豆甾醇(stigmast-5，12-dien-3-ol)分子式:C29H48O;2、豆甾-7，22-二烯-3-醇(stigmasta-7，22-dien-3-ol)，分子式:C29H48O;3、麥角甾-7，22-二烯-3-酮(ergosta-7，22-dien-3-one)，分子式:C28H44O;4、β-谷甾醇(β-sitosterol)，分子式:C29H50O;5、33-降柳珊瑚甾-5，24(28)-二烯-3-醇［33-norgorgosta-5，24(28)-dien-3-ol］，分子式:C29H46O。

由此可見，文冠果種仁油中的總甾醇主要由以上5 種單體組成，其功效與結(jié)構(gòu)的關(guān)系仍在研究之中;文冠果種仁油中是否存在新的甾醇物質(zhì)還需要進(jìn)一步探索。就目前而言，文冠果種仁油中甾醇主要是豆甾醇、麥角甾醇、β-谷甾醇和降柳珊瑚甾醇，其中C-3 羥基是甾醇的重要活性基團(tuán)，C-3 位羥基決定了甾醇多方面的生理活性功能。豆甾醇是合成甾體激素重要前體，可以用來生產(chǎn)黃體酮和孕酮;β-谷甾醇具有類似雌激素的作用，可以顯著影響動物血漿中睪酮的含量。因此，推測文冠果種仁油中甾醇對防治男性前列腺疾病和乳腺疾病或許有較好作用。

此外，根據(jù)文獻(xiàn)［18］推測降柳珊瑚甾醇是一種多羥基甾醇結(jié)構(gòu)，它具有一定的細(xì)胞毒活性，可能具有一定的抗癌活性。麥角甾醇是一種重要的原維生素D，經(jīng)紫外光照射能轉(zhuǎn)化成為維生素D2，維生素D2具有防治軟骨病的作用。麥角甾醇對確保細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性、膜的流動性、膜結(jié)合酶的活性、細(xì)胞的活力以及細(xì)胞運(yùn)輸物質(zhì)起著重要的作用。文冠果種仁油中的甾醇包含了這幾種甾醇，其是否具有協(xié)同增效作用還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗確定了文冠果種仁油中總甾醇的皂化法提取最佳條件為:乙酸乙酯用量200 mL，皂化溫度67 ℃，料液比1∶5 g/mL，皂化時間2 h;在此條件下文冠果種仁油中總甾醇含量達(dá)0.498%。由正交試驗結(jié)果的極差分析可知，影響提取文冠果總甾醇含量的主要因素依次為料液比(C)＞提取劑濃度(A)＞提取溫度(B)＞超聲功率(D)，該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。試驗確定的純化條件［料液比1∶5(g/mL)，結(jié)晶溫度60 ℃，結(jié)晶時間12 h］可將粗甾醇的純度從14%提高到55%，該方法有效。GC-FID 分析，確定了文冠果種仁油中總甾醇的基本組成，主要由有5 中單體，分別是豆甾醇、豆甾-7，22-二烯-3-醇、麥角甾-7，22-二烯-3-酮、β-谷甾醇、33-降柳珊瑚甾-5，24(28)-二烯-3-醇。

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