漢媛媛 ，張凱亮，高雪翔，李 潔，3，郭 琪，Juraev Firdavs，王 靜*

1蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000;2 甘肅省婦幼保健院，蘭州 730050;3 天津高等醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校，天津 300222

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)腫瘤之一，惡性程度較高，生長(zhǎng)快，浸潤(rùn)性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后較差［1］。目前治療提倡以手術(shù)、放射、化療為主，但是放射治療往往因其對(duì)正常組織的損傷，以及腫瘤組織對(duì)放射的抵抗限制了其臨床應(yīng)用［2］。作為增加腫瘤放射敏感性、提高放射治療療效的重要手段，應(yīng)用放射增敏劑成為提高放射治療增益比的重要手段。

吳茱萸堿(evodiamine，EVO)是蕓香科植物吳茱萸近成熟果實(shí)中提取的純天然化學(xué)成分，主要藥理作用有抗炎，抗血小板凝集，鎮(zhèn)痛，體溫調(diào)節(jié)等［3］。近年來(lái)眾多體內(nèi)外研究表明EVO 對(duì)宮頸癌［4］、肺癌、結(jié)腸癌［5］、肝癌［6］等多種腫瘤具有抑制其生長(zhǎng)的作用，前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)EVO 對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞有放射增敏的作用［7］，為了進(jìn)一步研究EVO 對(duì)其他腫瘤細(xì)胞是否也具有放射增敏作用，并且探討聯(lián)合作用中不同的加藥順序?qū)Ψ派涿舾行缘挠绊懯欠翊嬖诓町?，研究選用胃癌SGC7901 細(xì)胞，探討EVO 聯(lián)合射線對(duì)SGC7901 細(xì)胞放射敏感性的影響，并初步探討其可能的機(jī)制，以期為胃癌臨床放射增敏劑的選擇提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

EVO 購(gòu)自天津化標(biāo)生物技術(shù)有限公司;RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gbico 公司;新生牛血清購(gòu)自四季青公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，吉姆薩染液為武漢凌飛生物科技公司產(chǎn)品，碘化嘧啶(PI)購(gòu)自上海生工公司;Caspase3 兔抗人多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司;β-actin 兔抗人多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 購(gòu)自北京碧云天公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌SGC7901 細(xì)胞(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，另加2.2 mg/L 碳酸氫鈉，1000000 U 鏈霉素，800000 U 青霉素。置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 吳茱萸堿的配制

用DMSO 溶解EVO 并用RPMI-1640 將其配制成1000 μmol/L 的儲(chǔ)存液，使用時(shí)用RPMI-1640 稀釋成所需濃度，最終濃度分別為1、4、16 μmol/L。DMSO 濃度小于0.5%。

1.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

實(shí)驗(yàn)分組:(1)對(duì)照組(C):未作處理的SGC7901 細(xì)胞;(2)單獨(dú)加藥組(E):EVO 組;(3)單獨(dú)放射組(R):2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy;(4)聯(lián)合作用組(R+E):EVO 與放射線聯(lián)合作用組，其中聯(lián)合作用組又分為(A 組):放射前24 h 加藥;(B 組):放射后立即加藥。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901 細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后重懸于培養(yǎng)液中，以1.5 ×104個(gè)/mL 的密度均勻接種于96 孔板內(nèi)過(guò)夜。次日分別加入EVO，使藥物終濃度分別為1 μmol/L、4 μmol/L、16 μmol/L、每孔總體積為200 μL，每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。EVO 作用24、48、72 h 后加入MTT 20 μL/孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱4 h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μ/孔，振蕩混勻后于酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。確定EVO 濃度及作用時(shí)間后，聯(lián)合不同劑量射線(ELEKTA recise 醫(yī)用直線加速器的6 MV X 射線，放射野為40 cm×40 cm。放射源與培養(yǎng)瓶細(xì)胞面距離為100 cm，加入1.5cm 等效組織充填物)處理SGC7901 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次以上，取平均值。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)藥物組OD 值/空白對(duì)照組OD 值)× 100%。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901 細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后按照對(duì)照組200 個(gè)/孔，單獨(dú)放射組及聯(lián)合作用組400 個(gè)/孔，接種于6 孔板中，置于孵箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，待有肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，PBS 沖洗，甲醇固定，Gmisa 染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50 個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。接種率PE(plating efficiency)=(對(duì)照組細(xì)胞克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)) ×100%;存活分?jǐn)?shù)SF(surviving fraction)=實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/(細(xì)胞接種數(shù)×PE);采用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線得出放射生物學(xué)敏感參數(shù)Do 值(mean lethal dose)=1/K 及Dq 值(quasithreshold dose)=Do × lnN (extrapolation number)，根據(jù)公式:放射增敏比SER(sensitizing enhancement ratio)=單獨(dú)放射組Do 值/增敏劑+放射組的Do 值，求出放射增敏比。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)EVO 聯(lián)合放射線對(duì)胃癌細(xì)胞周期分布的影響

收集各組細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，棄上清，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇振蕩混勻后固定30 min，離心棄上清，加入100 μL 的PI 染料，振蕩混勻后室溫避光染色30 min，用BD 流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國(guó))進(jìn)行分析。

1.7 Western blot 檢測(cè)caspase 3 蛋白

收集各組細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞(RIPA 強(qiáng)裂解液，碧云天，PMSF 10 μL/ mL)30 min，提取總蛋白，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度。細(xì)胞總蛋白于95 ℃條件下變性5 min 后，取20 μg 上樣。SDS-PAGE 恒壓80 V 分離蛋白，隨后在恒流300 mA 條件下進(jìn)行常規(guī)濕轉(zhuǎn)1 h，PVDF 膜在搖床上室溫封閉60 min、4 ℃條件下caspase 3 一抗孵育過(guò)夜，TBST 洗膜10 min、3 次，室溫下?lián)u床孵育二抗2 h，TBST 洗膜10 min、3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光，顯影、定影，膠片曝光。β-actin 為內(nèi)參照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次以上，采用SPSS16.0 軟件，細(xì)胞增殖率，周期分布采用T 檢驗(yàn)分析，克隆形成實(shí)驗(yàn)采用origin Pro8 軟件擬合細(xì)胞存活曲線，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 EVO 單獨(dú)及聯(lián)合放射線抑制SGC7901 細(xì)胞的增殖

不同濃度的EVO 作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖的影響如圖1 所示，隨著作用濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)SGC7901 細(xì)胞增殖抑制率升高，EVO對(duì)SGC7901 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用有明顯的時(shí)間依賴性和濃度依賴性。1 μmol/L EVO 處理48 h 對(duì)SGC7901 細(xì)胞抑制率為15.2% (IC15)，為了避免EVO 單獨(dú)使用對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的較強(qiáng)的抑制作用，選擇1 μmol/L 藥物濃度作為EVO 聯(lián)合放射線的工作濃度，作用時(shí)間為48 h。隨著放射劑量的增加，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率增加，且較單獨(dú)放射組及單獨(dú)加藥組有明顯的抑制作用，其中聯(lián)合作用A 組對(duì)細(xì)胞的抑制效果要優(yōu)于聯(lián)合作用B 組(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 EVO 對(duì)SGC7901 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率Fig.1 SGC7901 cell survival rates after treated with EVO with different concentrations and time

圖2 EVO 聯(lián)合放射線對(duì)SGC7901 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率Fig.2 SGC7901 cell survival rates after treated with combination group

2.2 EVO 對(duì)SGC7901 細(xì)胞具有放射增敏作用

根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)，按單擊多靶擬合并繪制細(xì)胞的存活曲線。SGC7901 細(xì)胞經(jīng)單獨(dú)放射和聯(lián)合作用后的存活曲線見(jiàn)圖3，放射生物學(xué)敏感參數(shù)見(jiàn)表1，放射增敏比見(jiàn)表2。聯(lián)合作用組各劑量點(diǎn)的存活分?jǐn)?shù)、放射生物學(xué)敏感參數(shù)均低于單獨(dú)放射組，其中聯(lián)合作用A 組的放射增敏效果要優(yōu)于聯(lián)合作用B 組(P＜0.05)。

圖3 單擊多靶模型擬合細(xì)胞的劑量存活曲線Fig.3 The dose survival curves of SGC7901 cells by muititarget single hit model

表1 單獨(dú)放射線及EVO 聯(lián)合放射線組的放射生物學(xué)敏感參數(shù)Table 1 Radiobiology sensitive parameter

表2 SGC7901 細(xì)胞放射增敏比Table 2 SER of SGC7901

2.3 EVO 聯(lián)合射線影響SGC7901 細(xì)胞周期分布

EVO 聯(lián)合放射組與對(duì)照組及單獨(dú)放射組相比，細(xì)胞處于G2/M 期的比例顯著增加，其中聯(lián)合作用A 組對(duì)SGC7901 細(xì)胞G2/M 期的阻滯大于聯(lián)合作用B 組，見(jiàn)圖4(P＜0.05)。相關(guān)研究已證實(shí)，細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性增強(qiáng)與細(xì)胞G2/M 期阻滯有關(guān)G2/M 期的細(xì)胞對(duì)放射線敏感性最高［8］。

圖4 EVO 聯(lián)合放射線對(duì)SGC7901 細(xì)胞周期G2/M 期的阻滯率Fig.4 The rates of G2/M in different groups

2.4 EVO 聯(lián)合放射上調(diào)了SGC7901 細(xì)胞中凋亡蛋白caspase3 的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示聯(lián)合作用組相對(duì)于單獨(dú)放射組及單獨(dú)加藥組，細(xì)胞凋亡蛋白caspases3 表達(dá)上調(diào)，其中聯(lián)合作用A 組較聯(lián)合作用B 組Caspase3表達(dá)量上調(diào)更明顯，且隨放射劑量的增加其表達(dá)量逐漸增加見(jiàn)圖5。

3 討論

圖5 Western blot 法檢測(cè)SGC7901 細(xì)胞中caspase3 蛋白表達(dá)Fig.5 Effects of different groups on the protein level of SGC7901 cell

細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，EVO 對(duì)胃癌SGC7901 細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，且抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性。為了研究低濃度EVO 的放射增敏作用，研究選用了EVO IC15的劑量1 μmol/L，作為后續(xù)聯(lián)合作用的藥物劑量。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，EVO 聯(lián)合不同劑量射線在48 h 對(duì)SGC7901 細(xì)胞增殖的抑制率顯著高于單獨(dú)放射組和單獨(dú)用藥組，其中聯(lián)合作用先加藥A 組較聯(lián)合作用后加藥B 組對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用更強(qiáng)(P＜0.05)，提示EVO 聯(lián)合放射線降低了胃癌細(xì)胞的存活率，且先加藥的作用方式更利于殺傷細(xì)胞。Do 為平均致死劑量，反映不同細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性;Dq 為準(zhǔn)域劑量，反映細(xì)胞亞致死放射損傷的修復(fù)能力;SF2 可衡量細(xì)胞內(nèi)在放射敏感性?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EVO 聯(lián)合放射線組的SF2、Do、Dq 均低于單獨(dú)放射組，提示EVO 增強(qiáng)了SGC7901 細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，并且不同加藥順序?qū)Ψ派涿舾行缘挠绊懖煌?，先加藥使胃癌?xì)胞對(duì)射線的敏感性更強(qiáng)。

放射增敏劑是一種與射線共同使用時(shí)可提高射線殺傷作用的藥物，常用的放射增敏劑可以從多種途徑實(shí)現(xiàn)其增敏效果，主要包括:增加射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的原發(fā)性損傷，減弱放射后細(xì)胞亞致死性損傷的修復(fù)，改變細(xì)胞周期，促進(jìn)凋亡，以及影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等［9］。EVO 是一種從蕓香科植物吳茱萸近成熟果實(shí)中提取的天然藥物，具有副作用小，藥效廣泛等優(yōu)勢(shì)，前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)EVO 可增強(qiáng)舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞的放射敏感性［7］。本研究進(jìn)一步證明了EVO 同樣能夠?qū)ξ赴㏒GC7901 細(xì)胞產(chǎn)生放射增敏作用，并且加藥順序的不同影響著聯(lián)合作用的效果。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示EVO 對(duì)SGC7901 細(xì)胞有明顯細(xì)胞周期阻滯作用，且聯(lián)合作用組對(duì)細(xì)胞G2/M 期的阻滯率高于單獨(dú)放射組和單獨(dú)用藥組。細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性增強(qiáng)與細(xì)胞G2/M 期的阻滯有關(guān)［10］，細(xì)胞處于該時(shí)期更易受到放射線的傷害，最終導(dǎo)致死亡。EVO 對(duì)胃癌SGC7901 細(xì)胞周期阻滯可能是EVO 產(chǎn)生放射增敏作用的機(jī)制之一，與前期研究EVO 對(duì)口腔癌細(xì)胞的放射增敏作用研究結(jié)果相似［7］。

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞的生長(zhǎng)，增殖和分裂緊密聯(lián)系，并且在許多疾病的發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用［11］。caspase3 是細(xì)胞凋亡途徑中的經(jīng)典下游基因。細(xì)胞在接收到外界凋亡信號(hào)刺激后引發(fā)一系列凋亡信號(hào)的激活，分為細(xì)胞外途徑(或稱(chēng)細(xì)胞表面死亡受體途徑)和細(xì)胞內(nèi)途徑(或稱(chēng)線粒體引發(fā)途徑)，而在內(nèi)外兩條凋亡途徑的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中都會(huì)伴隨著caspase 家族基因的激活，caspase3 是這些途徑中較為重要的基因，該基因的活化可最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［12］。Western blot 結(jié)果顯示，聯(lián)合作用組與單獨(dú)放射組和單獨(dú)用藥組相比，caspase3 的表達(dá)量明顯增多，其中聯(lián)合作用組中不同加藥時(shí)序?qū)aspase3表達(dá)量的影響不盡相同，聯(lián)合作用組中先加藥A 組中凋亡蛋白capase3 的表達(dá)量高于后加藥B 組。凋亡蛋白表達(dá)量的增多說(shuō)明EVO 與射線聯(lián)合使用可能激活了凋亡途徑中的相關(guān)基因最終導(dǎo)致caspase3基因的激活，亦或是直接使caspase3 活化，發(fā)揮其促凋亡的作用，從而使癌細(xì)胞死亡率升高。

綜上所述，EVO 聯(lián)合放射治療能增強(qiáng)胃癌SGC7901 細(xì)胞的放射敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制，改變細(xì)胞周期分布，增加凋亡蛋白caspase3 的表達(dá)量，同時(shí)發(fā)現(xiàn)加藥順序的不同也影響著胃癌細(xì)胞對(duì)聯(lián)合作用不同的響應(yīng)，這對(duì)胃癌圍手術(shù)期放射治療中增敏劑給藥順序選擇提供了一定的理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，但EVO 的作用劑量、作用時(shí)間及具體的作用機(jī)制等還有待于進(jìn)一步體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)的證實(shí)。

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