金銀萍，侯 微，高 薇，王玉帥，焉 石，王英平

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112

皮膚是維持人體生命和健康的重要部分，直接與外界接觸，是機(jī)體的第一道屏障，極易受到環(huán)境因素的影響而導(dǎo)致?lián)p傷。人類皮膚的衰老是機(jī)體衰老最易觀察到的外部顯示，是整體衰老的局部表現(xiàn)。促使皮膚衰老的因素很多，除了先天與遺傳因素外，還受外界環(huán)境中諸多因素的直接影響如污染、陽光、紫外線的照射、應(yīng)激反應(yīng)等。隨著社會人口老齡化和生活環(huán)境的不斷惡化，以及人們生活水平的提升，預(yù)防和延緩皮膚衰老越來越受到人們的重視。在“回歸自然、崇尚天然”的潮流趨勢下，以植物來源的天然功能性化妝品，備受消費(fèi)者的青睞。

五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.是木蘭科(Magnoliaceae)五味子屬Schisandra多年生落葉藤本植物［1］。近年來有關(guān)五味子藥理活性的研究表明，五味子提取物及其所含的木脂素、多糖類等成分，均具有抗氧化活性［2-10］。但是，五味子對皮膚衰老方面的研究報道相對較少［11-13］。本試驗(yàn)通過H2O2造成HaCaT 細(xì)胞(人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞)自由基氧化損傷衰老模型，觀察五味子各組分抗皮膚細(xì)胞衰老效果，以期篩選得到五味子抗衰老護(hù)膚活性功能因子，為北五味子抗皮膚衰老產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

HaCaT 細(xì)胞購自上海川翔生物科技發(fā)展有限公司;五味子醇甲(批號110857)、五味子酯甲(批號111529)、五味子甲素(批號110764)、五味子乙素(批號110765)購自中國藥品生物制品檢定研究所，五味子醇乙(批號YY90208)購自上海源葉生物科技有限公司;RPMI 1640 培養(yǎng)基購自Gibco;胎牛血清購自Clack;胰蛋白酶購自HyClone;噻唑藍(lán)(MTT)、DPPH 購自Sigma;微量丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、微量還原型谷胱甘肽(GSH)測試盒購自南京建成生物工程研究所;總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS 法)購自碧云天生物技術(shù)研究所;30% H2O2購自天津市百世化工有限公司。

五味子果實(shí)采自吉林市左家鎮(zhèn)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所藥用植物資源圃，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所艾軍研究員鑒定為木蘭科(Magnoliaceae)五味子屬Schisandra五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.四年生果實(shí)。

1.2 儀器與設(shè)備

ST-360 酶標(biāo)儀(上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司);IBE1000 倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司);KDC-40 低速離心機(jī)(安徽中科中佳);HF151UV 二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司);FDU-2100 冷凍干燥機(jī)(日本EYELA);10AvP 高效液相色譜儀(日本SHIMADZU)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HPLC 分析五味子各組分木脂素含量

2.1.1 樣品制備

五味子果實(shí)提取物(SC)，上大孔吸附樹脂AB-8，靜置過夜，依次用H2O、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脫，每個梯度沖洗5 個保留體積，分別收集各梯度洗脫液，過濾，減壓濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍至干，備用。樣品組分依次命名為SC-0、SC-10、SC-30、SC-50、SC-70、SC-95。

2.1.2 色譜條件

Hypersil ODS2(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動相:乙腈(A)，水(B)。梯度洗脫模式:0～30 min，45%～75% A;30～35 min，75%～99% A;35～40 min，99%～45%;40～45 min，45%A;流速1 mL/min;檢測波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫為室溫。

2.1.3 樣品測定

準(zhǔn)確稱取五味子各組分樣品適量，按“2.1.2”條件進(jìn)行測定，以下列公式計算五味子醇甲等5 種木脂素的含量(mg/g):木脂素的含量=(C×D)/W式中:C 為測試液中各木脂素濃度(g/L)，D 為供試液的稀釋因子，W 為樣品的質(zhì)量(g)。

2.2 DPPH 法測定五味子各組分抗氧化能力

精密稱取DPPH 5.0 mg，用乙醇溶解并定容至100 mL 棕色容量瓶內(nèi)，避光保存?zhèn)溆?。將樣品溶液配制成不同質(zhì)量濃度梯度的待測液，混勻，備用。吸取待測樣品溶液0.1 mL 及3.9 mL 的DPPH 溶液，加入到5.0 mL 具塞試管中，搖勻，室溫避光放置90 min，取200 μL 加入96 孔酶標(biāo)板中，于517 nm 處測定吸光值A(chǔ)bS1，每次重復(fù)3 次。根據(jù)下列公式計算樣品自由基清除率，清除率(%)=［(AbS0-AbS1)/AbS0］×100，AbS0為空白對照0.1 mL 溶劑與3.9 mL DPPH 混合溶液的吸光值。清除DPPH 的能力用IC50值表示［14］。

2.3 ABTS 法測定五味子各組分總抗氧化能力

精密吸取待測樣品10 μL 置96 孔酶標(biāo)板上，加入工作液?？瞻兹芤何?0%乙醇10 μL，加入工作液，采用酶標(biāo)儀在734 nm 進(jìn)行測定。記錄吸光值，代入回歸方程計算［15］。

2.4 HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng)

取HaCaT 細(xì)胞在含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HaCaT 細(xì)胞，以1 ×105個/mL細(xì)胞接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h 備用。

2.5 細(xì)胞增殖檢測

實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、藥物處理組和藥物預(yù)處理后加H2O2組，每組至少3 個復(fù)孔?？瞻捉M給予完全培養(yǎng)基;模型組加入終濃度為1000 μmol/L H2O2的完全培養(yǎng)基，作用時間1 h;藥物處理組根據(jù)各組分的實(shí)際情況分為4 個不同劑量組，預(yù)處理作用時間24 h;藥物預(yù)處理后加H2O2組是加入受試藥物作用24 h 后，加入終濃度為1000 μmol/L H2O2的完全培養(yǎng)基作用1 h。利用MTT 法判斷各組細(xì)胞增殖情況。加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h 后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO 溶解沉淀物，振蕩器混勻后，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長下檢測OD 值。細(xì)胞存活率通過以下公式計算:細(xì)胞存活率(%)=(OD處理/OD空白)×100%［13］。

2.6 五味子組分對氧化損傷HaCaT 細(xì)胞MDA、SOD 和GSH 水平的影響

取空白對照組、H2O2損傷組、不同劑量活性組分處理組的HaCaT 細(xì)胞(處理方式同前)，按照MDA、SOD 和GSH 檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

廣東省未來煤電發(fā)展主要受限于煤炭消費(fèi)總量控制和環(huán)保容量約束。煤電行業(yè)污染物排放總量按照比2015年下降50%考慮，通過實(shí)施煤電機(jī)組超低排放改造，經(jīng)測算，廣東環(huán)保空間可支撐煤電裝機(jī)約110 GW。按照等煤量控制測算，當(dāng)電煤比例提高至75%時，廣東省可支撐煤電裝機(jī)約80 GW；當(dāng)電煤比例提高至80%時，廣東省可支撐煤電裝機(jī)約85 GW。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 HPLC 分析五味子組分木脂素含量

五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素是五味子中5 種主要的木脂素。按上述色譜條件進(jìn)行測定，計算其在各組分中的含量。從表1 結(jié)果可以得出，木脂素含量的大小順序?yàn)?SC-70 ＞SC-50 ＞SC-95 ＞SC-30。SC-0 和SC-10 不含木脂素類成分。

表1 五味子各組分中木脂素含量(n=3， ± s)Table 1 Lignan contents of S.chinensis fractions (n=3，± s)

表1 五味子各組分中木脂素含量(n=3， ± s)Table 1 Lignan contents of S.chinensis fractions (n=3，± s)

3.2 五味子各組分清除DPPH 自由基能力的測定

五味子各組分清除DPPH 自由基能力的大小順序依次為:VC(0.17) ＞ SC-50 (1.08) ＞ SC-30(1.06)＞SC-95 (20.64)＞SC-70 (27.18)＞SC-10 (33.43)＞SC-0。SC-0 在38.00 mg/mL 時其清除率只為7%，受樣品溶解度的限制，無法進(jìn)一步加大樣品濃度，且沒有實(shí)際意義，所以沒有求得具體IC50值。

五味子總提取物SC 經(jīng)大孔樹脂分離純化所得的各組分，與SC 相比均具有極顯著性差異(P＜0.01);除SC-30 和SC-50 外，SC 和其余組分與陽性對照(Vc)比較，均具有極顯著性差異(P＜0.01)，DPPH 自由基清除能力均低于Vc。

SC-30 和SC-50 的抗氧化能力明顯強(qiáng)于其它組分，且清除DPPH 自由基能力相當(dāng)，與SC 及其它組分段相比較具有極顯著性差異(P＜0.01)。

3.3 ABTS 法測定五味子各組分總抗氧化能力

結(jié)果顯示，五味子各組分總抗氧化能力的大小順序 為:SC-50 (5.127) ＞ VC(1.000)＞SC-30(0.765)＞ SC-70 (0.476)＞ SC-95 (0.058)＞SC-10 (0.012)＞SC-0。SC-0 其TEAC 值無限接近于0，沒有抗氧化活性;SC-50 的抗氧化能力與其它組分相比，具有極顯著性差異(P＜0.01)，且效果強(qiáng)于VC。

3.4 細(xì)胞增殖檢測

3.4.1 不同濃度五味子組分對細(xì)胞生長的影響

采用MTT 法檢測不同濃度五味子各組分對HaCaT 細(xì)胞生長得到影響。結(jié)果顯示，SC-0 和SC-10 在＜1000 μg/mL 時，除SC-10 在1000 μg/mL 時有細(xì)胞毒性之外，均不影響細(xì)胞的增殖;而其他組分在＞500 μg/mL 時，均對細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，減少細(xì)胞增殖在23%～97%左右;SC-50 在100～250 μg/mL 之間時，對細(xì)胞有明顯的增殖作用，細(xì)胞活力提高12%～18%左右，與正常對照組比較具有極顯著差異。具體如圖1 所示。

圖1 五味子各組分對細(xì)胞生長的影響(n=6，± s)Fig.1 Effects of different fractions of S.chinensis on cell viability (n=6，± s)

3.4.2 五味子各組分對H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

根據(jù)篩選得到的五味子各組分的安全劑量范圍，設(shè)定4 個不同劑量組，預(yù)處理時間為24 h，利用MTT 法判斷各組細(xì)胞增值情況。結(jié)果顯示，SC-0 在100～200 μg/mL、SC-30 在1～10 μg/mL 之間時，對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，但是與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);SC-10、SC-70 及SC-95 在安全劑量范圍內(nèi)，對細(xì)胞活力無明顯變化;SC-50 處理組的細(xì)胞存活率較H2O2處理組明顯提高(P＜0.05，P＜0.01)，且呈劑量依賴性，但伴隨濃度增加到一定程度，逐漸出現(xiàn)細(xì)胞凋亡甚至死亡，存活率開始下降。具體如圖2 所示。

3.5 五味子組分對氧化損傷HaCaT 細(xì)胞MDA、SOD 和GSH 水平的影響

圖2 五味子各組分對H2O2誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(n=6，± s)Fig.2 Protective effects of different fractions of S.chinensis against H2O2-induced oxidative stress injury in HaCaT cells (n=6，± s)

用1000 μmol/L H2O2處理HaCaT 細(xì)胞與空白相比，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA 增加21%左右，抗氧化酶SOD 降低64%左右，GSH 降低49%左右;而用測試組分處理之后，明顯降低了MDA 的生成，提高細(xì)胞內(nèi)SOD 以及GSH 的活力(P＜0.01)。150 μg/mL SC-50 能有效減少M(fèi)DA 生成量在37%左右，有效增加SOD 量在2.7 倍左右，增加GSH 量在1.8 倍左右。具體見表2。

表2 SC-50 組分對HaCaT 細(xì)胞中MDA、SOD 和GSH 水平的影響(n=3， ± s)Table 2 Effects of SC-50 on cellular MDA，SOD and GSH in HaCaT cells (n=3，± s)

表2 SC-50 組分對HaCaT 細(xì)胞中MDA、SOD 和GSH 水平的影響(n=3， ± s)Table 2 Effects of SC-50 on cellular MDA，SOD and GSH in HaCaT cells (n=3，± s)

注:與H2O2處理組比較，+P ＜0.05;≠P ＜0.01。Note:Compared with H2O2treated control，+P ＜0.05;≠P ＜0.01.

4 討論

中藥“組分結(jié)構(gòu)”理論認(rèn)為，中藥復(fù)方中各活性成分之間存在著一定的比例關(guān)系，組成物質(zhì)基礎(chǔ)的最基本單元為單體成分，具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu);由同一化學(xué)類別的單體成分按照一定的比例構(gòu)成組分，組分中各單體成分之間存在配伍配比關(guān)系;不同類別的組分按照一定的配伍比例組合構(gòu)成中藥復(fù)方的整體性物質(zhì)基礎(chǔ)［16］。因而本文以功能單位“組分”為基礎(chǔ)進(jìn)行五味子抗皮膚衰老方面的研究。

越來越多的研究表明，自由基可以從細(xì)胞水平、分子水平乃至組織器官水平上對機(jī)體造成各種不可逆性的氧化性損傷，加速生物體細(xì)胞乃至整個機(jī)體的衰老進(jìn)程，誘發(fā)各種與衰老相關(guān)的各種疾病［17-19］。人體細(xì)胞各種來源的大量自由基當(dāng)中，最引人關(guān)注、研究較多的是ROS。ROS 包括及HO2·、·OH 等。H2O2是細(xì)胞內(nèi)一種重要的氧自由基，對人體皮膚細(xì)胞能造成直接的氧化應(yīng)激反應(yīng)和氧化應(yīng)激所致的氧化性損傷。在體外利用H2O2能夠誘導(dǎo)細(xì)胞并加速細(xì)胞因氧化應(yīng)激所致的衰老進(jìn)程，模擬體內(nèi)氧化損傷的病理過程。

以DPPH 自由基清除能力和總抗氧化能力(ABTS 法)為考察指標(biāo)，對五味子各組分的自由基清除能力進(jìn)行評價，利用MTT 法篩選五味子各組分對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，50%乙醇洗脫組分有較強(qiáng)的自由基清除能力，并顯著減少M(fèi)DA 的生成，提高SOD 和GSH酶活性，這可能也是其對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

在前人文獻(xiàn)報道指出，聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素的抗氧化活性較好，本文檢測分析的五味子甲素、乙素等5 種主要木脂素均報道具有抗氧化的活性。從木脂素含量分布來看，50%乙醇組分不是木脂素含量最高的組分，但是抗氧化活性最強(qiáng)的組分。這也使我們對中藥“組分結(jié)構(gòu)”理論有了進(jìn)一步的理解和深思，進(jìn)而開展進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

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