馮曉帆，趙丹玉，柳 春，劉 戀，洪涌濤，劉博通

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110847

苦蕎麥［Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn］，又稱(chēng)烏麥、菠麥、花蕎，屬于雙子葉蓼科蕎麥屬植物，在我國(guó)大面積種植，區(qū)域主要集中在我國(guó)西南部高海拔、高寒、高原地區(qū)［1］?！侗静菥V目》中曾記載其有降氣寬腸健胃，行氣化瘀的作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)苦蕎麥對(duì)控制Ⅱ型糖尿病血糖水平有積極作用?？刂蒲撬降囊葝u素分泌后經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)輸至毛細(xì)血管，在穿過(guò)血管內(nèi)皮后作用于靶細(xì)胞，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。Ⅱ型糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的能力并沒(méi)有徹底喪失，而是一種相對(duì)缺乏，正常水平的胰島素不能充分產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，此即胰島素抵抗(insulin resistance，IR)。所以血管內(nèi)皮對(duì)胰島素的通透性是其最終能否充分發(fā)揮作用的關(guān)鍵。NO 是血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的重要血管舒張因子，其合成受胰島素抵抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(ADMA/NO)的調(diào)控［2］。

本實(shí)驗(yàn)前期研究苦蕎麥提取物苦蕎麥總黃酮，發(fā)現(xiàn)其具有改善血管微循環(huán)的作用［3］，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察苦蕎麥總黃酮對(duì)軟脂酸(Palmitic Acid，PA)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EA.hy926)中二甲基精氨酸二甲胺水解酶Ⅱ(DDAH2)表達(dá)的影響以及對(duì)非對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(ADMA)、NO 含量的影響，探討苦蕎麥總黃酮在Ⅱ型糖尿病發(fā)病過(guò)程中對(duì)胰島素抵抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(ADMA/NO)的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)相關(guān)臨床用藥提供科研依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株

EA.hy926 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.2 主要藥品和試劑

苦蕎麥總黃酮(日本三益制藥株式會(huì)社，顯色分光法測(cè)定藥物樣品中苦蕎麥總黃酮濃度為991.65 mg/g)，二甲雙胍(上海生工生物工程有限公司，批號(hào)為XZ0630S4011Z)，軟脂酸(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為100M12021V)。

胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗(美國(guó)Hyclone 公司)，兔抗人DDAH2一抗、兔抗人ADMA 一抗、兔抗人NOX4一抗(美國(guó)Proteintech Group公司)，羊抗兔IgG 二抗(Cell Signaling Technology公司)，RT-PCR 引物、RT-PCR 試劑盒、DNA Marker(大連寶生物工程有限公司)，NO 試劑盒(南京建成生物工程研究所)，ADMA 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器和設(shè)備

-80 ℃低溫冰箱(德國(guó)西門(mén)子公司);生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司);倒置顯微鏡(日本Olympus 公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司);Anthos 2010 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(奧地利CE 公司;臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司);Bio-Spec-nano 型紫外線可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);梯度PCR 儀(Bio-Rad 公司);EPS300 型電泳儀(上海天能科技有限公司);G:BOX 系列凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)SYNGENE 公司);半干式轉(zhuǎn)印儀(北京六一儀器廠);PVDF 膜(美國(guó)Millipore 公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在紫外燈滅菌后的超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作，將EA.hy926 細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基中，37 ℃的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代;取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞加入0.25%的胰酶400 mL/瓶對(duì)細(xì)胞消化;當(dāng)鏡下觀察到有細(xì)胞脫落時(shí)，倒掉胰酶，加入DMEM 完全培養(yǎng)基終止反應(yīng);吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液后，再分裝置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 模型建立

取生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞，先用胰酶消化后吹打均勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將單細(xì)胞懸液的密度稀釋到5 ×104后再接種到24 孔板上，200 μL/孔。為篩選出最適軟脂酸造模濃度，設(shè)定正常對(duì)照組和4 個(gè)不同濃度梯度的軟脂酸組，每組設(shè)6復(fù)孔，待細(xì)胞在37 ℃的培養(yǎng)箱中90%生長(zhǎng)融合時(shí)，除正常對(duì)照組，其他各組分別加濃度為300、400、500、600 μmol/L 的軟脂酸溶液，孵育1 h 后加入5 μL 濃度50 nmol/L 的胰島素溶液;測(cè)定MTT，篩選出軟脂酸造模的最佳濃度為600 μmol/L。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組

分為對(duì)照組、模型組、苦蕎麥總黃酮低、中、高劑量組和二甲雙胍組共6 組，各加入含10% 胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基和濃度為50 nmol/L 的胰島素，除對(duì)照組外其他各組加入濃度600 μmol/L 軟脂酸;苦蕎麥總黃酮組加入三種終濃度(31.25、62.5、125 μg/mL)的苦蕎麥總黃酮分別1.25、2.5 μL 和5 μL;二甲雙胍組加入終濃度2 mmol/L 二甲雙胍4 μL。

2.4 生化指標(biāo)測(cè)定

2.4.1 雙抗體夾心法測(cè)定ADMA 含量

按照ADMA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作:用ADMA抗體包被微孔板制固相抗體后，加入含有ADMA 的樣本，再加入HRP 標(biāo)記過(guò)的羊抗人抗體，構(gòu)成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，洗滌后加底物TMB 顯色，在酸的作用下由藍(lán)色變?yōu)榉€(wěn)定的黃色，ADMA 含量與顯色淺深正相關(guān)。于波長(zhǎng)450 nm 測(cè)定各樣本光密度。

2.4.2 硝酸還原酶法測(cè)定NO 含量

依照NO 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將紫外線可見(jiàn)分光光度計(jì)波長(zhǎng)設(shè)為550 nm，測(cè)定各樣本光密度，檢測(cè)所有的硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量。

2.4.3 RT-PCR 法測(cè)定DDAH2mRNA 表達(dá)

提取細(xì)胞的總RNA:將培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞用預(yù)冷PBS 沖洗3 次后加入1 mL Trizol，轉(zhuǎn)移到EP 管中吹打均勻，室溫靜置5 min 后加200 μL 氯仿，震蕩15 s后室溫靜置5 min，4 ℃條件下12000 rpm，離心5 min，吸上清轉(zhuǎn)移至新管并加入等體積異丙醇，混勻靜置10 min 后4 ℃條件下12000 rpm，離心10 min，棄上清，加入75 %乙醇1 mL 用于沉淀洗滌，12000 rpm，4 ℃離心5 min，再次棄上清加DEPC 水溶解RNA 沉淀。

按試劑盒說(shuō)明要求建立10 μL RT 反應(yīng)體系，先用分光光度法測(cè)定細(xì)胞總RNA 濃度，加樣量(μL)=0.5 μg/RNA 濃度(μg/μL)，反應(yīng)條件為30 ℃10 min，50 ℃30 min，95 ℃5 min，4 ℃∞;再建立25 μL PCR 反應(yīng)體系，其中DDAH2上游引物序列5'-TTCTCCACCAACTCTGTCCTC-3'，下游引物序列5'-CAACCGCTCGGATTTCTTA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為949 bp，退火56 ℃;β-actin 上游引物序列5'-ACACGAAAGCAATGCTATCACCTC-3'，下游引物序列5'-TGACAGCAGTCGGTTGGAGCGA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為153 bp，退火60 ℃;反應(yīng)條件設(shè)為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃30 s，退火30 s，72 ℃45 s，40 個(gè)循環(huán)，72℃5 min，4 ℃∞。取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和marker 各5 μL 分別與含有核酸染料的1 μL 上樣緩沖液混勻，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定各組樣本光密度值。計(jì)算目的基因條帶與對(duì)應(yīng)內(nèi)參β-actin 條帶光密度值的比值。

2.4.4 Western-blot 測(cè)定DDAH2蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞的總蛋白:倒凈培養(yǎng)瓶液體后加3 mL預(yù)冷PBS 清洗2 次，吸凈PBS 后加200 μL 蛋白裂解液，轉(zhuǎn)移至新EP 管中，冰上裂解30 min。4 ℃條件14000 rpm，離心10 min 后轉(zhuǎn)移上清液至新管中。用BCA 試劑盒檢測(cè)樣本蛋白質(zhì)濃度。

將各組樣本與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，把上樣量調(diào)整至55 μg 后進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳，恒壓進(jìn)行90 min，再恒流轉(zhuǎn)PVDF 膜90 min;5%脫脂奶粉封閉于37 ℃水浴中震蕩1 h，加入一抗兔抗人(1/100 封閉液稀釋)，4 ℃過(guò)夜;TBST 沖洗3 次，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(1/1000 封閉液稀釋)，37 ℃水浴中震蕩2 h，TBST 沖洗4 次，DAB 顯色。掃描條帶分析，計(jì)算各組目的蛋白條帶光密度值與對(duì)應(yīng)內(nèi)參GAPDH 蛋白條帶光密度值的比值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中ADMA 含量的變化

模型組與對(duì)照組比較，ADMA 含量明顯增加，有顯著性差異(P＜0.05);苦蕎麥中、高劑量組與模型組比較，ADMA 含量明顯減少，有顯著性差異(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

3.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NO 含量的變化

模型組與對(duì)照組比較，NO 含量明顯減少，有顯著性差異(P＜0.05);苦蕎麥中、高劑量組與模型組比較，NO 含量明顯增加，有顯著性差異(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ADMA 和NO 的含量(μmol/L，n=6，±s)Table 1 Contents of NO and ADMA in EA.hy926 cells of each group (μmol/L，n=6，± s)

表1 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ADMA 和NO 的含量(μmol/L，n=6，±s)Table 1 Contents of NO and ADMA in EA.hy926 cells of each group (μmol/L，n=6，± s)

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與模型組比較，＊＊P ＜0.05。Note:Compared with control group，* P ＜0.05;Compared with insulin resistance group，＊＊P ＜0.05.

3.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH2mRNA 表達(dá)情況

模型組與對(duì)照組比較，DDAH2mRNA 表達(dá)減少，有顯著性差異(P＜0.05);苦蕎麥總黃酮組與模型組比較，DDAH2mRNA 表達(dá)增加，有顯著性差異(P＜0.05)(見(jiàn)圖1、表2)。

圖1 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH2mRNA 和β-actin mRNA 表達(dá)Fig.1 Expression of β-actin mRNA and DDAH2mRNA in EA.hy926 cells of each group

表2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH2mRNA 相對(duì)表達(dá)(n=6， ± s)Table 2 Relative expression of β-actin mRNA and DDAH2mRNA in EA.hy926 cells of each group (n=6，± s)

表2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH2mRNA 相對(duì)表達(dá)(n=6， ± s)Table 2 Relative expression of β-actin mRNA and DDAH2mRNA in EA.hy926 cells of each group (n=6，± s)

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與模型組比較，＊＊P ＜0.05。Note:Compared with control group，* P ＜0.05;Compared with insulin resistance group，＊＊P ＜0.05.

3.4 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH2蛋白表達(dá)情況

模型組與對(duì)照組比較，DDAH2蛋白表達(dá)量減少，有顯著性差異(P＜0.05);苦蕎麥總黃酮組與模型組比較，DDAH2蛋白表達(dá)量增加，有顯著性差異(P＜0.05)(見(jiàn)圖2、表3)。

圖2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH2蛋白和GAPDH 蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of DDAH2protein and β-actin protein in EA.hy926 cells of each group

表3 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH2蛋白相對(duì)表達(dá)(n=6，± s)Table 3 Relative expression of DDAH2protein and β-actin protein in EA.hy926 cells of each group (n=6， ± s)

表3 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH2蛋白相對(duì)表達(dá)(n=6，± s)Table 3 Relative expression of DDAH2protein and β-actin protein in EA.hy926 cells of each group (n=6， ± s)

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與模型組比較，＊＊P ＜0.05。Note:Compared with control group，* P ＜0.05;Compared with insulin resistance group，＊＊P ＜0.05.

4 討論

本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的ADMA、NO、DDAH2為ADMA/NO 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的三項(xiàng)重要指標(biāo)，該通路與Ⅱ型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)。其中ADMA 主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，超過(guò)90%的ADMA 可被甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)代謝［4］。DDAH 存在2種異構(gòu)體:DDAH1和DDAH2，其中DDAH2主要在有eNOS 的組織中表達(dá)［5］。有資料顯示，Ⅱ型糖尿病患者在內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能減弱的同時(shí)會(huì)有ADMA 水平的升高，而且內(nèi)皮功能失調(diào)的嚴(yán)重程度與血漿中ADMA 水平呈正相關(guān)［6-8］;另有研究發(fā)現(xiàn)ADMA 血漿水平與NO 水平呈負(fù)相關(guān):給予健康人高脂飲食，發(fā)現(xiàn)血漿中ADMA 濃度也升高，并且血流依賴(lài)的血管舒張作用減低，NO 血漿含量降低。NO 是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要信號(hào)分子，NO 具有擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)血壓、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等生物學(xué)作用，還可以使胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中某些分子作用下降，進(jìn)而影響胰島素發(fā)揮正常的生物學(xué)效應(yīng)，引起外周組織產(chǎn)生胰島素抵抗(IR)［9］。IR 是指胰島的β 細(xì)胞能分泌正常水平的胰島素，但不能夠使靶細(xì)胞產(chǎn)生正常的胰島素效應(yīng)，無(wú)法激活靶細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致胰島素相對(duì)不足［10］。IR引起對(duì)葡萄糖的利用能力降低，因?yàn)槠咸烟抢脺p少引起血糖水平升高，誘發(fā)Ⅱ型糖尿病，而代償性胰島素增加，可同時(shí)表現(xiàn)為高胰島素血癥。也有研究曾提示Ⅱ型糖尿病胰島素敏感性與NO 之間的關(guān)系:當(dāng)胰島素敏感性降低出現(xiàn)IR 時(shí)，由于高血糖和高胰島素血癥的存在，能直接損傷血管內(nèi)皮，引起NO 減少，進(jìn)一步可降低相應(yīng)受體對(duì)胰島素的敏感性，加重IR［11］。

由上可知，ADMA/NO 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中ADMA、DDAH2的基因及蛋白表達(dá)變化都會(huì)對(duì)NO 的含量產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響IR 及Ⅱ型糖尿病的發(fā)展。因此，無(wú)論是通過(guò)降低ADMA 水平來(lái)增加NO 合成;或者是通過(guò)提高DDAH2水平，增加對(duì)ADMA 的分解代謝來(lái)增加NO 合成，都能增加血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的釋放量，提高血管通透性，使到達(dá)靶細(xì)胞的胰島素增加，這對(duì)于緩解IR 十分重要。

根據(jù)文獻(xiàn)中高濃度的PA 能夠使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損引起IR［12］，本實(shí)驗(yàn)以高濃度PA 作為造模條件，用于EA.hy926 細(xì)胞建立IR 細(xì)胞模型，成模后以不同濃度的苦蕎麥總黃酮作為干予因素，檢測(cè)各組ADMA 生成量、NO 釋放量以及DDAH2基因和蛋白表達(dá)情況，探討在IR 狀態(tài)下，血管內(nèi)皮受損傷的可能機(jī)制，進(jìn)一步為苦蕎麥總黃酮作為治療Ⅱ型糖尿病的臨床有效藥物成分提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。模型組與對(duì)照組比較，ADMA 含量明顯增加，DDAH2mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)減少，NO 含量明顯減少，均有顯著性差異(P＜0.05)，這一結(jié)果表明成功的建立了IR細(xì)胞模型;而苦蕎麥中、高劑量組與模型組比較，ADMA 含量明顯減少，DDAH2mRNA 表達(dá)及蛋白表達(dá)量增加，均有顯著性差異(P＜0.05)，說(shuō)明苦蕎麥總黃酮能夠降低血糖的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)ADMA/NO 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中ADMA、DDAH2的基因及蛋白表達(dá)變化來(lái)提高NO 的含量，進(jìn)而抑制IR，控制Ⅱ型糖尿病的發(fā)展。

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