張文會，孫同韋，張會圖，王海寬，王洪彬，路福平

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，工業(yè)酶國家工程實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

近年來，隨著人們環(huán)保意識的增強以及綠色飼料的興起，對β-甘露聚糖酶在飼料工業(yè)的應用已成為一個新的研究熱點[1].甘露聚糖占飼料中非淀粉多糖的30%,，是目前大量應用的玉米/豆粕型飼料中主要的抗營養(yǎng)因子[2].它們能結合大量的水分，使采食動物消化道中食糜的體積增大、黏度增加、養(yǎng)分與消化道內源酶的作用降低、營養(yǎng)物質的消化率下降，造成動物生長受阻、飼料轉化率降低，從而使其代謝受到抑制[3].在飼料中添加甘露聚糖酶能有效消除它們的抗營養(yǎng)作用，提高動物的生產性能[4].另外，添加β-甘露聚糖酶后，在動物體內能夠產生甘露寡糖，可進一步刺激和增強動物的免疫反應，調控動物胃腸道微生態(tài)環(huán)境，促進有益菌生長，抑制有害菌黏附[5].目前已發(fā)現的β-甘露聚糖酶種類很多，其中不乏催化性能優(yōu)良的高比活β-甘露聚糖酶[6-8].而真正應用于飼料添加劑的β-甘露聚糖酶則為數不多，并且很難發(fā)揮理想效果.究其原因，是由于大部分β-甘露聚糖酶的酸穩(wěn)定性較差，難以耐受單胃動物消化道中的強酸環(huán)境以及消化道中由酸性至中性的變化過程；另外也有一些β-甘露聚糖酶由于受到消化液中蛋白酶的降解作用而迅速失活[9].因此，尋找具有耐酸、抗蛋白酶特性的新型β-甘露聚糖酶是解決這一問題的關鍵所在.

本研究以尋找適合用于飼料添加劑的新型β-甘露聚糖酶為目標，從一株可大量分泌表達蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus sublitis)TCCC11286 中篩選分離到一種具有耐酸抗蛋白酶特性的β-甘露聚糖酶.

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus sublitis)TCCC11286，本實驗室保藏.

1.2 主要試劑

胰蛋白酶，上海伯奧公司；角豆膠、甘露糖，Sigma 公司；其他試劑均為國產分析純.

從國內3 個商家所購買的β-甘露聚糖酶酶粉分別標記為A、B、C.

1.3 培養(yǎng)基

β-甘露聚糖酶產生菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：角豆膠5，蛋白胨2，酵母浸出物2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.25，瓊脂2.

牛奶篩選培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，脫脂奶粉30，瓊脂20，pH 7.0～7.2.

LB 培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出物5，胰蛋白胨10，NaCl 10.

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：魔芋粉10，酵母膏2，MgSO40.3，FeSO40.01，K2HPO42，NaCl 1，(NH4)2SO45，吐溫80 1，pH 7.0～7.2.

1.4 蛋白酶及β-甘露聚糖酶產生菌的篩選

蛋白酶產生菌的篩選：通過LB 固體培養(yǎng)基三區(qū)劃線將來自實驗室的枯草芽孢桿菌菌株在37,℃培養(yǎng)24,h，進行純化和活化.將平板上長出的單菌落依次點接到牛奶篩選培養(yǎng)基上，37,℃培養(yǎng)24,h，產生蛋白酶的菌落周圍將會出現透明圈，保存透明圈較大的菌株.

β-甘露聚糖酶產生菌的篩選：將初篩得到的蛋白酶產生菌株依次點接到牛奶篩選培養(yǎng)基上、β-甘露聚糖酶產生菌篩選培養(yǎng)基上，37,℃培養(yǎng)24,h，將0.1%,剛果紅溶液傾倒于長出菌落的篩選平板上，10～15,min 后倒去剛果紅溶液，用l mol/L 的NaCl 溶液反復沖洗2～3 次；然后加入l mol/L NaCl 溶液靜置15,min 后倒掉，此時，產生β-甘露聚糖酶的菌落周圍將會出現透明圈，保存透明圈較大的菌落.

1.5 β-甘露聚糖酶酶活的測定

β-甘露聚糖酶能將甘露聚糖降解成寡糖和單糖.具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS 試劑發(fā)生顯色反應.反應液顏色的強度與酶解產生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中β-甘露聚糖酶的活力成正比.因此，通過分光比色測定反應液顏色的強度，可以計算反應液中β-甘露聚糖酶的活力.

酶活單位定義：在pH 5.5、50,℃條件下，每分鐘內底物降解釋放1,μmol D-甘露糖所需要的酶量為1個酶活單位U.

酶活測定：取 0.5,mL 適當稀釋的酶液加入1.5,mL 0.5%,角豆膠溶液，50,℃保溫20,min，加入2,mL DNS，沸水浴10,min，冷卻至室溫后用去離子水定容至15,mL；空白對照：0.5,mL 適當稀釋的酶液加入2,mL DNS，50,℃保溫20,min，加入1.5,mL 角豆膠溶液，沸水浴10,min，冷卻至室溫后用去離子水定容至15,mL.在波長550,nm 的條件下測定吸光度.

1.6 β-甘露聚糖酶的純化

1.6.1 粗酶液的制備

將枯草芽孢桿菌TCCC11286 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，37,℃、170,r/min 培養(yǎng)48,h.將發(fā)酵液在4,℃、12,000,r/min 離心10,min，收集上清液，即為粗酶液.

1.6.2 硫酸銨鹽析

采用分步鹽析法.粗酶液中添加(NH4)2SO4至50%,飽和度，4,℃靜置過夜，4,℃、8,000,r/min 離心20,min，棄沉淀；上清液繼續(xù)添加(NH4)2SO4至80%,飽和度，4,℃靜置過夜，離心，沉淀備用.

1.6.3 陰離子交換層析

將沉淀用pH 5.5 的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解，透析袋透析脫鹽，上樣至已用乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡過的Hitrap Q HP 陰離子柱(5,cm×5,cm)上，階段洗脫.用含有1,mol/L NaCl 的磷酸緩沖液以0～100%,的梯度進行洗脫，流量為0.5,mL/min，收集洗脫峰，測定各管的β-甘露聚糖酶活性.合并較高酶活性的收集液，透析，并利用超濾管進行濃縮.

1.6.4 凝膠過濾層析

將離子交換層析后的β-甘露聚糖酶的活性組分收集濃縮，然后上樣至預先用乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡好的分子篩(Superdex 200 10/300,GL)上，用相同的緩沖液進行洗脫，流量為0.5,mL/min，收集濃縮含有β-甘露聚糖酶活性組分.對各步純化組分進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測.

1.7 β-甘露聚糖酶酶學性質的測定

1.7.1 最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性

采用pH 5.5 的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制β-甘露聚糖酶活性測定反應體系，將反應體系分別置于30～75,℃的溫度下進行酶促反應，測定其酶活力.酶活力最高的溫度為最適反應溫度，其酶活力設為100%,，計算其他溫度下的相對酶活力.將酶液分別置于30～75,℃處理60,min 后，測定酶活力，以0,℃下處理的β-甘露聚糖酶酶活力定為100%,，計算各溫度處理后的相對酶活力，分析其溫度的穩(wěn)定性.

1.7.2 最適反應pH 及pH 穩(wěn)定性

采用pH 2～12 的0.2,mol/L 的緩沖液(pH 2.0～8.0,Na2HPO4-檸檬酸，pH 9～10 甘氨酸-NaOH，pH 11.0～12.0,Na2HPO4-NaOH)配制β-甘露聚糖酶的催化反應體系，將反應體系于50,℃反應15,min 后測定酶活力，酶活力最高的pH 為最適pH，其酶活力設為100%,，計算其他pH 條件下的相對酶活力.采用pH 2～12 的不同的緩沖液處理酶液1,h 后，測定酶活力，以酶活力最大的pH 下的酶活力設為100%,，計算各pH 處理下的相對酶活力，分析其pH 的穩(wěn)定性.

1.7.3 不同金屬離子與化學試劑對β-甘露聚糖酶穩(wěn)定性的影響

分別用1,mmol/L 和5,mmol/L 的金屬離子溶液及其他化學試劑溶解酶解底物，測定酶活力，以未添加任何金屬離子和化學試劑的底物下測得的酶活力為100%,，計算加入金屬離子和其他化學試劑下的相對酶活力，研究金屬離子和其他化學試劑對該酶活力的影響.

1.8 β-甘露聚糖酶的耐酸抗蛋白酶測試

將純化后的β-甘露聚糖酶與市面上的商業(yè)酶(編號A、B、C)進行耐酸抗蛋白酶比較實驗.1,mL 酶液加入到9,mL 50,mmol/L pH 2.0 的甘氨酸-鹽酸緩沖液中，37,℃、120,r/min 孵育1,h，測定酶活力，以未處理過的酶活力定為100%,，計算各酶液處理后的相對酶活力，分析其穩(wěn)定性.各取上述孵育液1,mL，加入到含有0.1%,胰蛋白酶的9,mL 20,mmol/L pH 5.5 乙酸-乙酸鈉緩沖液中，37,℃繼續(xù)孵育2,h，測定酶活力.以未經胰蛋白酶處理過的上述孵育液酶活力定為100%,，計算其處理后的相對酶活力，分析其穩(wěn)定性.

2 結果與分析

2.1 蛋白酶和β-甘露聚糖酶產生菌的篩選

蛋白酶產生菌的篩選結果如圖1(a)所示，產蛋白酶的菌落周圍會形成透明圈.β-甘露聚糖酶產生菌的篩選結果如圖1(b)所示，產β-甘露聚糖酶的菌落周圍會形成透明圈.

圖1 產β-甘露聚糖酶和蛋白酶菌株的篩選Fig.1 Isolation of strains producing the new β-mannanase and protease

2.2 β-甘露聚糖酶的純化

將枯草芽孢桿菌 TCCC11286 搖瓶發(fā)酵，收集粗酶液，利用80%,的硫酸銨鹽析離心后上清液中的β-甘露聚糖酶酶活力最低，透析液在過陰離子交換柱時出現3 個峰，并且只有第2 個峰收集液測到β-甘露聚糖酶的酶活力，將收集液經過凝膠過濾層析純化后，比酶活由560,U/mg 提高到8,232.6,U/mg，純化倍數達到14.7 倍，回收率為47%,.SDS-PAGE 結果如圖2 所示.由圖2 可以看出，純化后的β-甘露聚糖酶是相對分子質量為3.7×104的單一條帶.

2.3 β-甘露聚糖酶酶學性質分析

將β-甘露聚糖酶純酶液分別在不同pH 的緩沖體系中測定其酶活力，以pH 為橫坐標，相對酶活力為縱坐標繪制曲線，結果如圖3 所示，β-甘露聚糖酶的最適pH 為5.5，且在pH 2.0～10.0 范圍內，酶活力保持在60%,以上.因此β-甘露聚糖酶在pH 2.0～10.0 之間比較穩(wěn)定，有比較寬的pH 穩(wěn)定范圍，有很好的耐酸特性.該酶比已報道的酶更具有酸、堿穩(wěn)定性[10]，這一特點更有利于該酶在飼料添加劑中的使用.

圖2 各個純化步驟樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.2 SDS-PAGE of the mannanase sample in each purification procedure

圖3 β-甘露聚糖酶的最適pH及pH穩(wěn)定性Fig.3 The optimal pH and pH stability of the new βmannanase

在不同的溫度(30～70,℃)下測定β-甘露聚糖酶純酶液的酶活力，并計算相對酶活力.以溫度為橫坐標，相對酶活力為縱坐標繪制曲線，結果如圖4 所示.結果表明：β-甘露聚糖酶的最適反應溫度為50,℃，且在30～60,℃范圍內，酶活力保持在60%,以上，在60,℃以上β-甘露聚糖酶的酶活力降到40%,以下.該酶的最適溫度與大部分的來源于枯草芽孢桿菌的β-甘露聚糖酶相似，而B.,subtilis 168 的最適反應溫度卻是37,℃[11].β-甘露聚糖酶的溫度穩(wěn)定性有利于飼料添加劑的保存與運輸.

圖4 β-甘露聚糖酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.4 The optimum temperature and thermal stability of the new β-mannanase

不同濃度的化學試劑及金屬離子對β-甘露聚糖酶活性的影響結果如圖5 所示.對于不同金屬離子和化學試劑對β-甘露聚糖酶活性的影響結果表明：金屬離子Hg2+和Ag+、表面活性劑SDS、吐溫20、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)對該β-甘露聚糖酶有不同程度上的抑制作用，Na+、Ni2+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Pb2+、乙二胺四乙酸(EDTA)對該酶的酶活力基本沒有影響，Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe3+對該酶有明顯的激活作用.作為飼料添加劑，這一特性有利于抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶[12-14].

圖5 不同濃度的化學試劑及金屬離子對β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.5 Effects of metal ions and chemical reagents on the activity of the new β-mannanase

2.4 β-甘露聚糖酶的耐酸抗蛋白酶測試

用分離純化到的β-甘露聚糖酶進行耐酸抗蛋白酶的測試，并與國內所售的3 種β-甘露聚糖酶進行比較，結果如圖6 所示.枯草芽孢桿菌TCCC11286產的β-甘露聚糖酶耐酸相對酶活力在70%,以上，抗蛋白酶相對酶活力在60%,以上，均高于其他3 種β-甘露聚糖酶.因此，枯草芽孢桿菌TCCC11286 合成的β-甘露聚糖酶的耐酸抗蛋白酶活性較優(yōu)，該酶在飼料添加劑的應用中具有很大的潛能.

圖6 β-甘露聚糖酶的耐酸和抗蛋白酶實驗結果Fig.6 Acid and protease resistance experiment of the new β-mannanases

3 結論

本研究從一株高產蛋白酶的枯草芽孢桿菌中分離純化到一種新型β-甘露聚糖酶，其最適反應溫度為55,℃，最適pH 為5.5，在pH 2～10 的范圍內穩(wěn)定性較好，Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe3+對該酶有明顯的激活作用，此外，其具有良好的耐酸抗蛋白酶的特性，因此Bacillus subtilis TCCC11286 所合成的β-甘露聚糖酶是非常有價值的飼料添加劑原料，可進行深入研究，以實現β-甘露聚糖酶的工業(yè)化應用.雖然該酶的酶活力距離應用的要求還有一定的差距，但可以通過優(yōu)化發(fā)酵條件或者誘變育種和結合分子手段構建高效表達的工程菌提高產量，以達到實際應用的目的.

［1］龍健兒，陳一平.β-甘露聚糖酶的研究現狀[J].微生物學雜志，1998，18(3)：44-49.

［2］Cai Hongying，Shi Pengjun，Luo Huiyang，et al.Acidic β-mannanase from Penicillium pinophilum C1：Cloning，characterization and assessment of its potential for animal feed application[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2011，112(6)：551-557.

［3］王金偉，夏中生，何仁春，等.飼糧中添加非淀粉多糖酶對斷奶仔豬生長性能和血清生化指標的影響[J].糧食與飼料工業(yè)，2013(2)：44-47.

［4］Li Yihang，Chen Xiang，Chen Yiqun，et al.Effects of βmannanase expressed by Pichia pastoris in corn-soybean meal diets on broiler performance，nutrient digestibility，energy utilization and immunoglobulin levels[J].Animal Feed Science and Technology，2010，159(1)：59-67.

［5］de Vries R.Regulation of Aspergillus genes encoding plant cell wall polysaccharide-degrading enzymes；relevance for industrial production[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2003，61(1)：10-20.

［6］Jiang Zhengxiang，Wei Yun，Li Daoyi，et al.High-level production，purification and characterization of a thermostable β-mannanase from the newly isolated Bacillus subtilis WY34[J].Carbohydrate Polymers，2006，66(1)：88-96.

［7］Mudau M M，Setati M E.Screening and identification of endomannanase-producing microfungi from hypersaline environments[J].Current Microbiology，2006，52(6)：447-481.

［8］崔福綿，石家驥，魯茁壯.枯草芽孢桿菌中性 β-甘露聚糖酶的產生及性質[J].微生物學報，1999，39(1)：60-63.

［9］董桂清，余鈞池，羅永偵，等.β-甘露聚糖酶產生菌的篩選和酶學性質研究[J].廣西輕工業(yè)，2007，23(4)：20-21.

［10］Ma Yanhe，Xue Yanfen，Dou Yuetan，et al.Characterization and gene cloning of a novel β-mannanase from alkaliphilic Bacillus sp.N16-5[J].Extremophiles，2004，8(6)：447-454.

［11］El-Helow E R，Khattab A A.The development of a Bacillus subtilis 168 culture condition for enhanced and accelerated beta-mannanase production[J].Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica，1995，43(4)：289-299.

［12］Mendoza N S，Arai M，Kawaguchi T，et al.Purification and properties of mannanase from Bacillus subtilis[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，1994，10(5)：551-555.

［13］Yang Peilong，Li Yanan，Wang Yaru，et al.A novel βmannanase with high specific activity from Bacillus circulans CGMCC1554：Gene cloning，expression and enzymatic characterization[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2009，159(1)：85-94.

［14］Zhang Min，Chen Xiulan，Zhang Zhihua，et al.Purification and functional characterization of endo-βmannanase MAN5 and its application in oligosaccharide production from konjac flour[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2009，83(5)：865-873.