趙榮慧 鄭立雙 馬連順 牛嗣云

（1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)室，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河北 保定071000；3.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000）

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的持續(xù)發(fā)展，人類壽命不斷延長(zhǎng)，社會(huì)老齡化問(wèn)題日益加劇[1]。到2020年，我國(guó)老年人口將達(dá)到2.5億[2]。自40歲開(kāi)始，人類腎臟開(kāi)始衰老[3]。伴隨著腎臟重量減少，功能健全的腎小球逐漸減少。流行病學(xué)調(diào)查顯示，慢性腎臟疾病(CKD)患病率隨增齡而大幅度增加[4]。

何首烏飲是祖國(guó)醫(yī)學(xué)的奇葩。具有保護(hù)腎臟，延緩衰老作用[5]。面對(duì)衰老帶來(lái)的諸多社會(huì)醫(yī)學(xué)問(wèn)題，開(kāi)展老年醫(yī)學(xué)研究，探討何首烏飲延緩衰老機(jī)制，對(duì)臨床有一定的指導(dǎo)意義。

CD26是白細(xì)胞分化抗原之一，具有獨(dú)特的二肽基肽酶IV活性，可以分解N端第2位脯氨酸的多肽物質(zhì)生成一段兩肽[6]。CD26對(duì)含有脯氨酸的多肽在腎臟的轉(zhuǎn)運(yùn)以及腸道中的消化過(guò)程中起著重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重200-220g雄性Wistar大鼠30只(由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供)12月齡大鼠10只，18月齡大鼠20只。

1.2 何首烏飲方劑組成

何首烏（炙）、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊藿、丹參、茯苓按質(zhì)量比3：2：3：2：5：3 比例混合，水浸泡 1 小時(shí)，水煎 2 次，30 分鐘/次,過(guò)濾后濃縮至含生藥 4.8g*ml-1，4℃保存，給藥前復(fù)溫至 25-30℃[7－8]。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗鼠CD26一抗，SABC(兔IgG)-POD Kit試劑盒，恒溫箱。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

30只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后分組，10只12月齡大鼠作為青年對(duì)照組，20只18月齡大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為自然衰老模型組和何首烏飲干預(yù)組。全程給予普通飲食，何首烏飲干預(yù)組第二天開(kāi)始每天給予何首烏飲1ml/100g灌胃，自然衰老模型組給予等量生理鹽水灌胃。共60天。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水、活動(dòng)。

1.5 標(biāo)本收集

最后一次灌胃4小時(shí)后斷頭處死大鼠，取腎臟中性甲醛固定，常規(guī)脫水。

1.6 免疫組化法觀察CD26在腎臟分布

從4%中性甲醛中取出腎組織，經(jīng)脫水機(jī)脫水后，包埋制成蠟塊，將蠟塊切成大約4um的切片以備用。切片經(jīng)烤片30 min后經(jīng)三次二甲苯和三次乙醇中脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫室溫處理10分鐘，滅活過(guò)氧化氫酶，用PBS洗3次。熱修復(fù)抗原，將切片浸入0.01M檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）,微波爐加熱至沸騰后斷電，6分鐘后，反復(fù)此次操作。冷卻后 PBS(pH7.0)洗滌 3 次[9]。

比例稀釋，滴加稀釋的一抗37℃孵育1小時(shí)。PBS(pH7.2)洗滌3次,每次2分鐘。用稀釋滴加5%BSA封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。用稀釋液將一抗按一定液將Bio-羊抗兔IgG濃縮液按1：100稀釋成工作液，滴加Bio-羊抗兔IgG工作液，37℃孵育30分鐘，PBS(pH7.2)洗滌3次,每次2分鐘。用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1：100稀釋成工作液，滴加SABC-POD工作液，37℃孵育30分鐘，PBS(pH7.2)洗滌 4 次,每次 5 分鐘。

DAB顯色，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，20分鐘后，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染。依次加稀鹽酸乙醇，稀氨水，水洗10分鐘。

脫水：80%乙醇2分鐘，90%乙醇2分鐘，95%乙醇3分鐘，無(wú)水乙醇5分鐘，無(wú)水乙醇5分鐘；二甲苯5分鐘2次。晾干?？鞠?0℃2分鐘。滴加中性樹(shù)膠，蓋上蓋玻片封片。

顯微鏡觀察。200倍光鏡下記錄每張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)視野將其陽(yáng)性細(xì)胞的均數(shù)作為表達(dá)數(shù)[10]。

2 結(jié)果

（1）各組大鼠一般情況：青年對(duì)照組大鼠活潑，何首烏飲干預(yù)組大鼠毛色稍暗，活動(dòng)可，自然衰老對(duì)照組大鼠毛色枯黃，懶動(dòng)。

（2）免疫組化結(jié)果顯示：與青年對(duì)照組相比，CD26+T細(xì)胞在衰老對(duì)照組大鼠腎臟間質(zhì)明顯聚集(P＜0.05)，在何首烏飲干預(yù)組聚集程度較衰老對(duì)照組明顯減少(P＜0.05)。

圖1

3 討論

CD26由二個(gè)同源亞單位組成，通過(guò)N端親水區(qū)粘附于細(xì)胞膜上。又稱二肽酰肽酶IV，是一種高度糖基化的Ⅱ型跨膜蛋白，CD26是一種絲氨酸蛋白水解酶，可以在多肽的倒數(shù)第二個(gè) L-脯氨酸或 L-丙氨酸處，切除N-末端的二肽。[11]

CD26的底物包括一大類含有脯氨酸的肽，如生長(zhǎng)因子、趨化因子、神經(jīng)肽及血管活性肽。CD26參與免疫調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡，并在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。[12]

腎間質(zhì)是位于腎單位與集合管之間的結(jié)締組織，內(nèi)含細(xì)胞纖維和基質(zhì)部分，對(duì)腎血管起著支持作用[13]。有研究表明，CD26在糖尿病腎臟小鼠腎間質(zhì)T細(xì)胞有明顯浸潤(rùn)，它是T細(xì)胞活化的輔助分子，CD26分子的廣泛交聯(lián)能導(dǎo)致T細(xì)胞的直接激活。CD26以膜結(jié)合形式分布于多種細(xì)胞的Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有蛋白水解作用。CD26是一種多功能蛋白，是細(xì)胞膜受體和共刺激分子，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、等過(guò)程[12]。我們研究發(fā)現(xiàn)，在衰老大鼠腎臟間質(zhì)，CD26高表達(dá)。在T細(xì)胞識(shí)別抗原過(guò)程中，CD26提供共刺激信號(hào)，輔助T細(xì)胞活化。

本研究證實(shí)CD26與CKD（慢性腎臟疾?。┚哂邢嚓P(guān)性，何首烏飲對(duì)衰老大鼠腎臟的干預(yù)可能通過(guò)抑制T淋巴細(xì)胞增殖減少CD26在腎間質(zhì)的表達(dá)，從而起到保護(hù)腎臟，延緩衰老作用。

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