常欣峰　林樂迎　宋春花

摘 要：目的：觀察高效免疫調節(jié)劑（HIS）對人宮頸癌HeLa細胞增殖的影響。方法：制備HIS含藥血清，采用MTT法檢測HIS含藥血清對HeLa細胞增殖的影響，AnnexinⅤ/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡。結果：與對照組比較，HIS含藥血清對HeLa細胞生長有一定的抑制作用（p<0.01），并呈明顯的時效量效關系；而隨著HIS劑量的增加，各含藥血清組細胞凋亡比例亦相應增加，與對照組比較有顯著性差異（p<0.01）。結論：HIS對宮頸癌細胞生長有明顯的抑制作用，同時可以調節(jié)細胞周期，促進細胞凋亡。

關鍵詞：高效免疫調節(jié)劑；人宮頸癌HeLa細胞；增殖

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，嚴重威脅廣大婦女的生命和健康。宮頸癌的治療是一個及其復雜的過程，如何糾正宮頸癌患者的整體免疫系統(tǒng)恢復到正常和協調上來，恢復機體的免疫監(jiān)視，防止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移是宮頸癌治療的關鍵之一。為此，我們采用多價疫苗組成的高效免疫調節(jié)劑（high-efficiency immune modulators， HIS），制備成含藥血清，對人宮頸癌HeLa細胞進行體外培養(yǎng)，觀察HIS對宮頸癌細胞增殖的影響。

1 材料

1.1 動物及細胞株

雄性SD大鼠，體重250-280g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（動物中心許可證號：SCXK（湘）2011-0003，動物合格證號：43004700003244，級別：SPF級）。人宮頸癌HeLa細胞人肝癌細胞株Bel-7402，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥研究所購進，贛南醫(yī)學院科研中心傳代培養(yǎng)。

1.2 藥品和試劑

胎牛血清（Gibco，10099-141）、1640培養(yǎng)基（Gibco，12800-058）、0.25%胰酶（Gibco，25200-056）、MTT Formazan（Sigma，M2003-1G）、PI Annexin Ⅴ apoptosis detection kit（美國BD公司，3018688）

2. 方法

2.1 實驗藥物配置

HIS（中國發(fā)明專利申請?zhí)枺?00810107096.6）由江中腫瘤治療研究組提供，將其配置成0.3 g/mL，此為中劑量，再分別濃縮、稀釋成0.9 g/mL、0.1 g/mL，此為高、低劑量。4℃冰箱保存，大鼠按0.1 mL/100 g腹股溝皮下注射給藥，每日一次。

2.2 含藥血清制備

將20只清潔級SD大鼠隨機分成4組：A、正常對照組；B、HIS低劑量組；C、HIS中劑量組；D、HIS高劑量組。A組每天腹股溝皮下注射生理鹽水0.1mL/100g；B、C、D組分別給予低、中、高劑量HIS腹股溝皮下注射0.1mL/100g；連續(xù)治療3天，于末次給藥1h后，乙醚麻醉，腹主動脈取血，分離血清。將同組大鼠血清混勻， 56℃，30min水浴滅活，0.22μm薄膜濾菌器過濾，密封冷藏備用。

2.3 宮頸癌細胞HeLa的復蘇與培養(yǎng)

HeLa細胞株復蘇，CO2孵箱（5%CO2，37℃，95%濕度）傳代培養(yǎng)，3代后用于以下實驗。

2.4 MTT法檢測HIS含藥血清對HeLa細胞增殖的影響

將細胞數量調整為5×10/mL接種至96孔培養(yǎng)板，每孔200uL，分4組（正常血清對照組，HIS含藥血清低、中、高劑量組），每組8個復孔，培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)液， 加含10%各組相應血清的1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入MTT 20μL，37℃作用4h，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜 100μL，37℃、l0min輕輕搖動培養(yǎng)板，上機檢測，計算細胞增殖抑制率。

2.5 AnnexinⅤ/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡

常規(guī)培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)液， 加含10%相應血清的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，棄培養(yǎng)液，胰酶消化，收集細胞，離心，棄上清。取適量AnnexinⅤ Binding Buffer 重懸，計數，調細胞劑量為1×106個/mL，取40uL 細胞（即4×104個）放入離心管中。每管加AnnexinⅤ、PI各2uL，混合后避光放置15min，上機檢測。

3 實驗結果

3.1 HIS含藥血清對HeLa細胞增殖的影響

與對照組比較，各組HIS含藥血清對HeLa細胞生長有一定的抑制作用（p<0.01），并呈明顯的時效量效關系。提示HIS含藥血清能夠抑制宮頸癌細胞HeLa的增殖。（見表1）

3.2 AnnexinⅤ/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡

實驗結果表明，隨著HIS劑量的增加，細胞凋亡比例亦相應增加，分別為：（11.26±1.59）%、（17.67±1.72）%、（24.58±1.86）%，與正常血清對照組（6.92±1.07）%比較有顯著性差異（p<0.01）提示HIS含藥血清可以促進Bel-7402細胞凋亡。

4 討論

宮頸癌是指發(fā)生在宮頸陰道部或移行帶的鱗狀上皮細胞及頸管內膜的柱狀上皮細胞交界處的惡性腫瘤，其治療是一個復雜的過程，目前臨床常見的治療手段是手術和放、化療，其療效值得肯定，但仍存在著一些弊端和毒副作用。

在動物實驗中，我們觀察了HIS對S180肉瘤小鼠腫瘤的影響，結果證實HIS可有效增強小鼠免疫功能[1]，同時促進腫瘤細胞凋亡 [2]。本次實驗我們制備HIS含藥血清，對人宮頸癌HeLa細胞進行體外培養(yǎng)，觀察HIS對宮頸癌細胞增殖的影響。結果表明HIS能夠有效抑制HeLa細胞的增殖，促進細胞凋亡，這為進一步在臨床應用HIS治療宮頸癌提供了實驗依據。

參考文獻

[1]常欣峰，宋春花，羅寶英，等. 高效免疫調節(jié)劑對S180肉瘤小鼠IL-6及IL-10表達的調節(jié)作用[J].長春中醫(yī)藥大學學報，2013，29（12）：958-960.

[2]常欣峰， 宋春花， 張志花，等. 高效免疫調節(jié)劑促進肉瘤小鼠腫瘤細胞凋亡實驗研究[J].吉林中醫(yī)藥，2013，33（7）：717-719.