卓 越 劉陳立

(中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學工程研究中心 深圳 518055)

腫瘤細菌療法綜述

卓 越 劉陳立

(中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學工程研究中心 深圳 518055)

早在 150 年前，活細菌就已經(jīng)被用來治療癌癥。1868 年，德國醫(yī)生 Busch首先報道了部分腫瘤患者在感染肺炎鏈球菌后，體內的腫瘤生長被抑制甚至被徹底清除。在之后的三十年內，美國醫(yī)生 Coley 和另外一名德國醫(yī)生 Fehleisen 又分別報道了細菌感染可以抑制腫瘤這一現(xiàn)象。由于其結果難以重復，細菌的毒力也難以控制，這些早期的研究工作一直存在爭議。然而經(jīng)過嚴謹?shù)膭游飳嶒?，細菌的侵染被證實確實可以使腫瘤變小，宿主的免疫系統(tǒng)也會在治療的過程中被激活。文章將嘗試綜述腫瘤細菌療法的發(fā)展歷程和展望其發(fā)展方向。

細菌；癌癥治療；免疫系統(tǒng)；合成生物學

1 引 言

作為威脅人類生命健康的主要疾病之一，對癌癥，特別是復發(fā)和轉移癌癥始終缺乏有效的治療方法。無論是放療、化療、手術還是靶向性藥物，往往都不能取得令人滿意的療效。這一現(xiàn)狀促使人們不斷尋找新的癌癥治療方法。早在 19世紀初，人們就觀察到一些發(fā)生嚴重細菌感染的癌癥患者的腫瘤縮小甚至消失。受此啟發(fā)，開始有人嘗試利用細菌來治療癌癥。最早有文獻記錄使用細菌治療癌癥的案例發(fā)生在 1868 年，德國醫(yī)生 Busch 有目的性地讓惡性肉瘤(Sarcoma)患者感染化膿性鏈球菌(Streptococcus pyrogenes)，并觀察到感染者的腫瘤體積縮小[1]。之后，德國醫(yī)生 Fehleisen 于 1883 年，美國醫(yī)生 Coley 于1891 年，分別獨立報道了化膿性鏈球菌感染導致惡性肉瘤患者痊愈的病例[2,3]。

2 腫瘤細菌療法的發(fā)展

如前所示，雖然使用細菌治療腫瘤的早期嘗試獲得了一定成果，但存在很大的缺陷：首先，使用致病性活菌，可能造成患者的嚴重感染，安全性差；其次，細菌對腫瘤的療效存在很大的個體差異，缺乏重復性。因此，在兩位接受細菌治療的腫瘤患者死于感染后，為了提高可操作性并降低風險，Coley 醫(yī)生轉而使用包含滅活的化膿性鏈球菌、粘質沙雷菌(Serratia marcescens)等細菌的制劑(Coley’s Toxin)來進行治療[4,5]。他使用這種制劑先后治療了上千例各類腫瘤患者，在相當一部分患者身上取得了明顯的療效(圖 1)[6,7]。據(jù)后人統(tǒng)計，其成功率并不低于放療、化療和手術等治療方法[8]。

圖 1 患有圓形細胞肉瘤的患者，使用 Coley’s Toxin 治療后，腫瘤明顯縮小(該病人 10 年后仍存活)[6,7]Fig. 1 Treatments with Coley’s Toxin on a patient with round cell sarcoma of the jaw and abdominal metastases(The patient was still alive 10 years later)[6,7]

另一方面，人們也開始尋找更加安全的細菌種類。由于腫瘤組織內部血管系統(tǒng)的異常增生，無法形成正常的血液循環(huán)，因而會形成一種厭氧、酸性、缺乏營養(yǎng)的特殊微環(huán)境。嚴格厭氧生長的梭狀芽孢桿菌(Clostridium)就因此成為了腫瘤治療的理想候選菌種之一[9]。早在 1955 年就有報道稱，靜脈注射破傷風梭菌(Clostridium tetani)的荷瘤小鼠在 48 小時內死于破傷風，而無腫瘤小鼠不受影響[10]；1964 年另一則報道指出，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)會選擇性地生長于實體瘤中[11]；在 2001 年有報道指出，在數(shù)十種梭菌中只有敗毒梭菌(Clostridium sordellii)和諾維氏梭菌(Clostridium novyi)能夠擴散生長到整個腫瘤厭氧區(qū)[12]；2014 年，Roberts等[13]通過在狗及人體腫瘤內部直接局部注射諾維氏梭菌，取得了顯著的療效。

梭菌用作癌癥治療，除了源自嚴格厭氧特性的腫瘤靶向性，還有一個優(yōu)勢是能夠產(chǎn)生芽孢，在操作上具有很大的便利。然而，絕大多數(shù)梭菌都具有很強的致病性，對生物安全性的顧慮將極大地限制其應用。故而也有很多使用非致病菌來治療腫瘤的嘗試。1980 年有報道稱，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)對腸癌的發(fā)生具有抑制作用[14]，同年另一則報道指出，兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)能夠生長于多種小鼠腫瘤內部[15]；據(jù) 1997 年一則報道，嗜酸乳桿菌對人類乳腺癌細胞增殖具有抑制作用[16]；2000 年報道，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)能對IL-12 產(chǎn)生受損的晚期腫瘤產(chǎn)生抑制作用[17]，而長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)能夠選擇性地生長于肺癌腫瘤內部厭氧區(qū)[18]。

乳桿菌、雙歧桿菌等非致病菌用于腫瘤治療固然具有較高的安全性，然而另一方面其抑癌能力也相對較弱。細菌對腫瘤的抑制作用機理至今尚未被完全認識，已知的抑癌能力主要源自以下幾個方面：(1)細菌在腫瘤內部增殖，將同癌細胞競爭營養(yǎng)和氧氣；(2)細菌自身及其產(chǎn)物對癌細胞產(chǎn)生直接殺傷；(3)細菌的免疫源性激活免疫系統(tǒng)，從而引發(fā)對癌細胞的殺傷。因此，致病菌的自身毒性和免疫毒性，在腫瘤治療中具有積極的方面。有報告指出，細菌產(chǎn)生的內毒素可以刺激免疫細胞分泌活性因子，從而抑制癌細胞生長甚至殺死癌細胞[19,20]。在 2012 年報道的一次一期臨床實驗中證實，Coley’s Toxin 這種滅活致病菌的作用機理是通過激發(fā)患者的免疫反應來抑制腫瘤[21]。在現(xiàn)代醫(yī)學中，使用細菌治療癌癥的一個成功臨床案例就是對經(jīng)電灼或局部切除后的膀胱癌患者使用用卡介苗(BCG)進行膀胱內灌注，30 多年來隨機對照研究及大量臨床循證醫(yī)學實踐證實，這一療法能夠減少膀胱癌的復發(fā)，提高患者生存率及延長生存時間[8]?？ń槊缡菧p毒牛型結核桿菌(Mycobacterium bovis)懸液制成的活菌苗，灌注膀胱后可在局部產(chǎn)生一系列免疫級聯(lián)反應，刺激免疫細胞分泌 TNFa、IL-12 等因子從而促使腫瘤細胞凋亡[22-24]。

為此，人們開始尋求能夠在生物安全性和抑癌能力兩方面取得更好平衡的細菌菌株和療法。革蘭氏陰性兼性厭氧的菌鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)因為具有遺傳背景清晰、遺傳操作成熟等優(yōu)點，被認為是改造、應用前景最好的細菌種類之一。1997 年有報道指出，鼠傷寒沙門氏菌具有明顯的腫瘤靶向性，在腫瘤組織與正常組織中生長的數(shù)量比為 1000∶1[25]；2000 年有報道，敲除鼠傷寒沙門氏菌 lipid A 相關基因(waaN)的減毒仍能保留其腫瘤靶向性[26]；而在 2002 年，同時敲除waaN和purl(嘌呤營養(yǎng)缺陷型)的鼠傷寒沙門氏菌 VNP20009 菌株作為腫瘤治療藥物通過一期臨床實驗證明了其全性，但沒能取得理想的療效[27]。各種早期研究表明，無論采用馴化、篩選的天然菌株，還是進行簡單基因改造的細菌，都難以在降低對正常組織毒性的同時保持對腫瘤的殺傷能力，必須進行各種深度改造。

3 對細菌的深度改造

第一種改造途徑是努力提高細菌對腫瘤的靶向性。以鼠傷寒沙門氏菌為例，其本身為兼性厭氧菌，因而雖然在腫瘤組織與正常組織中生長的數(shù)量比能達到 1000∶1[25]，但仍會造成嚴重的感染，為了保證生物安全性而大幅度削弱了毒性的菌株則無法取得理想的抑癌效果[27]。為此，黃建東教授團隊在具有較強毒性的鼠傷寒沙門氏菌SL7207 菌株的基礎上，改造出 YB1 菌株，使其只能在較嚴格的厭氧環(huán)境中生長，從而特異性地靶向腫瘤內部，同時還能保持較好地抑制腫瘤生長(圖 2)[28]。

另一種改造途徑是提高減毒細菌對癌細胞的殺傷能力。例如細菌與功能納米材料的結合：2007 年即有報道，將李斯特菌(Listeria Monocytogenes)與包含 DNA 的納米顆粒結合，能夠將 DNA 投遞到細胞中表達目標基因(圖3(a))[29]；在 2013 年的另一則報道中，攜帶放射性顆粒的李斯特菌，能夠高效地靶向腫瘤，并抑制轉移性的胰腺癌(圖 3(b))[30]。或者使細菌能夠在腫瘤內部表達活性因子：2001 年的一則報道中，通過改造梭菌使其可以在腫瘤內部表達腫瘤壞死因子 A(TNFα)，并且很巧妙地設計其由涉及修復 DNA 單鏈斷裂的 recA 啟動子控制，從而可被化療射線觸發(fā)[31]；2006 年有報道，利用細菌在腫瘤內部表達 siRNA 可以有效抑制腫瘤生長[32]。

細菌對腫瘤的獨特靶向能力，也可以用于腫瘤的診斷。在 2015 年的一則報道中(圖 4)，大腸桿菌經(jīng)口服進入小鼠體內后，將會選擇性地生長在肝癌轉移瘤內，即使新生的轉移瘤直徑只有 1～2 毫米。這些大腸桿菌經(jīng) IPTG 誘導表達 β-半乳糖苷酶，分解靜脈注射進入體內的底物LuGal(熒光素-半乳糖融合分子)產(chǎn)生熒光素。最終通過檢測尿液中排出的熒光素，就能判斷小鼠體內是否有轉移腫瘤及其大致數(shù)量[33]。

圖 2 改造具有腫瘤靶向性的鼠傷寒沙門氏菌 YB1[28]Fig. 2 Tumor targeting Salmonella typhimurium strain YB1[28]

圖 3 李斯特菌與功能納米顆粒結合抑制腫瘤[29,30]Fig. 3 Combinations of Listeria monocytogenes and nanoparticles for cancer therapy[29,30]

圖 4 改造大腸桿菌檢測轉移腫瘤[33]Fig. 4 Detection of metastatic tumors with engineered E. coli[33]

4 前景展望

多年的研究和實踐證明，相比傳統(tǒng)藥物和療法，細菌作為具有生命的細胞，應用于癌癥治療中有其先天優(yōu)勢。譬如：(1)對腫瘤區(qū)域有天然靶向性，例如生長在厭氧環(huán)境中的細菌，會選擇性地生長在內部具有厭氧微環(huán)境的實體腫瘤中；(2)基因組龐大，可以進行大規(guī)模改造，攜帶多種元件模塊；(3)生長簡單可控，能深入腫瘤內部并大量繁殖，進而通過營養(yǎng)競爭、產(chǎn)生毒素等方式抑制和殺滅傳統(tǒng)放、化療方法難以起作用的癌細胞；(4)培養(yǎng)成本低；(5)可以作為天然的免疫調節(jié)劑，激發(fā)自身免疫增強抗癌效果。

而要使細菌，特別是一些原本是致病菌的細菌走出實驗室應用于臨床治療，就必須解決如何提高對腫瘤的靶向能力，在降低毒性以保證安全性的前提下，保持良好的腫瘤抑制能力這一關鍵問題。利用合成生物學等新興生物技術來改造細菌，能夠實現(xiàn)很多傳統(tǒng)方法無法完成的改造，賦予細菌更復雜的功能：對多種腫瘤和癌細胞進行更智能的識別、在腫瘤深處釋放理想的活性治療因子殺死癌細胞、吸引并集聚免疫細胞到腫瘤內進而激活自身免疫系統(tǒng)的抑癌作用，等等(圖5)。合成生物學也必將會是腫瘤細菌療法最重要、最有潛力的發(fā)展方向。

圖 5 合成生物學技術改造細菌治療腫瘤Fig. 5 Bacterial cancer therapy powered by synthetic biological technologies

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Review on Bacterial Cancer Therapy

ZHUO Yue LIU Chenli

(Center of Synthetic Biology Engineering Research,Shenzhen Institutes of Advanced Technology,Chinese Academy of Sciences,Shenzhen518055,China)

As early as in the second half of the 19th century, bacteria have already been used to treat cancer patients. In 1868, German doctor W. Busch reported that when patients with Sarcoma were intentionally infected by Streptococcus pyrogenes, the tumors were suppressed or eliminated. Later, similar cases of bacterial cancer treatments were reported by American doctor William B. Coley and German doctor Friedrich Fehleisen, independently. However, these early attempts remain controversial due to lack of repeatability and safety. In recent years, systematically designed animal experiments have proved that bacterial treatments can effectively suppress tumor growth and also stimulate immune system of the hosts. In this article, we will try to give out an outline of the history, development and future of bacterial cancer therapy.

bacteria; cancer therapy; immune system; synthetic biology

Q 939.99

A

2015-05-01

：2015-06-05

卓越，博士，副研究員，碩士生導師，研究方向為腫瘤合成生物學治療、細胞內物質輸送與神經(jīng)退行性疾病的關系；劉陳立(通訊作者)，博士，研究員，博士生導師，研究方向為合成細胞(人造生命)、腫瘤合成生物學治療、生物定向進化及海洋應用微生物研究，E-mail：cl.liu@siat.ac.cn。