馬衛(wèi)列，龔曉華，李觀強(qiáng)，丁 航，蘭柳波，陳小誼，張志珍△

(1.廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東東莞 523808；>2.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518172)

·技術(shù)與方法·

HPLC法測定apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞膽固醇流出的實(shí)驗(yàn)研究*

馬衛(wèi)列1，龔曉華1，李觀強(qiáng)2，丁 航1，蘭柳波1，陳小誼1，張志珍1△

(1.廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東東莞 523808；>2.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518172)

目的建立用高效液相色譜(HPLC)法測定載脂蛋白A-1(apoA-1)介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率的實(shí)驗(yàn)方法。方法人單核細(xì)胞THP-1用160 nmol/L佛波酯(PMA)誘導(dǎo)24 h分化為貼壁巨噬細(xì)胞(PMA組)，再用50 μg/mL乙?；兔芏戎鞍?ac-LDL)處理48 h，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞變成泡沫細(xì)胞(ac-LDL組)；加入含apoA-1的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h(apoA-1組)。油紅O染色和HPLC法測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，鑒定巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。采用HPLC分析和液體閃爍計(jì)數(shù)法測定apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率。結(jié)果THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞經(jīng)油紅O染色后，細(xì)胞內(nèi)可明顯觀察到大量紅色脂滴存在。膽固醇水平測定顯示，ac-LDL組內(nèi)游離膽固醇、總膽固醇和膽固醇酯的水平明顯高于PMA組(P<0.01)。ac-LDL處理細(xì)胞48 h后，ac-LDL組內(nèi)總膽固醇水平為80.25 μg/mg細(xì)胞蛋白，膽固醇酯水平為47.65 μg/mg細(xì)胞蛋白，占總膽固醇的59.38%，與PMA組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。HPLC分析和液體閃爍計(jì)數(shù)法結(jié)果表明，apoA-1介導(dǎo)泡沫細(xì)胞內(nèi)apoA-1組膽固醇流出率分別為5.63%和7.08%(P<0.01)。結(jié)論本研究成功建立了酶促反應(yīng)結(jié)合HPLC測定泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的方法，為后續(xù)研究細(xì)胞脂質(zhì)代謝提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

色譜法，高效液相；泡沫細(xì)胞；載脂蛋白A-1；膽甾烯酮；膽固醇流出

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是大多數(shù)心腦血管疾病發(fā)生的前期病理基礎(chǔ)[1-2]，在AS發(fā)生、發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞(foam cells)形成是動脈粥樣損傷形成的特征性改變，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯的流出是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇動態(tài)平衡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積和AS防治意義重大[3]。一般細(xì)胞在攝取膽固醇時(shí)會啟動胞內(nèi)膽固醇的正常流出，而泡沫細(xì)胞則表現(xiàn)為膽固醇代謝失調(diào)，主要是由于細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯過度堆積和膽固醇流出受阻，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯水平占總膽固醇的50%以上[4]。高密度脂蛋白介導(dǎo)膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞流出是清除細(xì)胞內(nèi)過量膽固醇的最主要途徑[5-6]，膽固醇以囊泡分泌形式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[7]，在此過程中有高密度載脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1，apoA-1)的介導(dǎo)[8]。研究apoA-1所介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞膽固醇流出的重要環(huán)節(jié)之一就是要準(zhǔn)確測定細(xì)胞內(nèi)各種膽固醇的水平以及膽固醇的流出率，為此，本文的目的就是采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測定apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中的膽固醇水平，計(jì)算膽固醇流出率，從而建立一種非同位素的較準(zhǔn)確測定泡沫細(xì)胞膽固醇流出率的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人單核細(xì)胞THP-1購自湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。

1.1.2 試劑 佛波酯(phorbol-1-myristate-13-acetate，PMA)購自Promega公司；乙?；兔芏戎鞍?acetylated low-density lipoprotein，ac-LDL)購自Biochemical Techologies公司；[3H]-膽固醇購自PerkinElmer公司；膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、膽甾烯酮標(biāo)準(zhǔn)品、apoA-1和油紅O染料購自Sigma公司；TritonX-100購自上海生工公司；HPLC級甲醇購自天津大茂公司；BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 主要儀器 1200型高效液相色譜儀(Agilent公司)；液體閃爍計(jì)數(shù)儀(PerkinElmer公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和生物安全柜(NUAIRE公司)；TS100倒置相差顯微鏡(Nikon公司)；5417R型高速臺式離心機(jī)(Eppendorf公司)；多功能酶標(biāo)儀(基因有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立 THP-1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，2～3 d傳代1次，3～5代后可用于建立巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞。THP-1細(xì)胞傳代至6孔板(1×106個(gè)/孔)，加入PMA至終濃度160 nmol/L，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，使懸浮細(xì)胞分化為貼壁巨噬細(xì)胞。更換培養(yǎng)基，加入ac-LDL至終濃度50 μg/mL，繼續(xù)孵育48 h，誘導(dǎo)貼壁巨噬細(xì)胞分化為泡沫細(xì)胞。同時(shí)設(shè)PMA對照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。

1.2.2 油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞 吸去6孔板中培養(yǎng)基，PBS漂洗3次。泡沫細(xì)胞用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定10 min；PBS洗1次，加入50%異丙醇作用5 min；吸去異丙醇，加入0.5%油紅O室溫染色15 min。60%異丙醇漂洗3～5次，蘇木素染色4 min，自來水沖洗反藍(lán)；PBS漂洗1次，置倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.3 HPLC法測定泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平 參考文獻(xiàn)[9]方法，PMA組和ac-LDL組THP-1細(xì)胞用PBS洗2次，加入1 mL 0.1% TritonX-100裂解，收集至1.5 mL離心管，BCA法測定蛋白水平。取100 μL細(xì)胞裂解液，加入10 μL酶促反應(yīng)混合液[含500 mmol/L MgCl2、500 mmol/L Tris(pH 7.4)、10 mmol/L DTT、5%膽酸鈉]混勻。實(shí)驗(yàn)分兩管，一管加入膽固醇氧化酶(終濃度0.4 U/mL)，37 ℃水浴作用1 h，用于測定細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇(FC)；另一管加入膽固醇酯酶(終濃度0.4 U/mL)，37 ℃作用1 h后，再加入膽固醇氧化酶于37 ℃作用1 h，用于測定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)。之后，兩組分別加入100 μL甲醇∶乙醇(1∶1)終止反應(yīng)，4 ℃靜置30 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，HPLC檢測FC和TC水平。色譜條件：色譜柱(Agilent TC-C18柱，4.6 mm×250.0 mm，質(zhì)點(diǎn)大小為5 μm，孔大小為100 ?)；流動相，100%甲醇；流速，1 mL/min；檢測波長，240 nm；柱溫，25 ℃；進(jìn)樣量，標(biāo)準(zhǔn)品5 μL，細(xì)胞樣品50 μL。以膽甾烯酮作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)樣品峰面積和所測蛋白濃度，計(jì)算出FC和TC水平，以單位質(zhì)量蛋白質(zhì)所含膽固醇表示(μg/mg)。膽固醇酯(CE)的水平為TC水平減去FC水平；CE百分水平(%)= CE水平/TC水平×100%。

1.2.4 HPLC法測定apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞膽固醇流出 THP-1細(xì)胞接種6孔板，在PMA和ac-LDL作用下誘導(dǎo)分化為泡沫細(xì)胞；每孔加入1 mL RPMI 1640培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃平衡培養(yǎng)24 h；用無血清培養(yǎng)基漂洗1次，加入1 mL含apoA-1的1640培養(yǎng)基(apoA-1終濃度為10 μg/mL)，5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。同時(shí)設(shè)泡沫細(xì)胞對照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。收集培養(yǎng)基，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液加入3倍體積氯仿∶甲醇(2∶1)，混勻，置4 ℃冰箱過夜后，5 000 r/min離心10 min，收集下層有機(jī)相；取上層再加入2倍體積氯仿，4 ℃冰箱4～5 h，5 000 r/min離心10 min，重復(fù)抽提，收集下層有機(jī)相；合并兩次收集的下層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?。將氮?dú)獯蹈傻闹|(zhì)加入10 μL甲醇溶解，再加入100 μL 0.1% Triton X-100混勻，HPLC測定培養(yǎng)基中的FC水平，色譜條件同上。細(xì)胞內(nèi)總膽固醇測定方法同上述1.2.4。

apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞膽固醇流出率按下列公式計(jì)算：膽固醇流出率(%)= 培養(yǎng)基中FC水平/(細(xì)胞內(nèi)TC水平 + 培養(yǎng)基中FC水平)×100。

1.2.5 液體閃爍計(jì)數(shù)法測定apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞膽固醇流出 THP-1細(xì)胞接種24孔板，PMA作用24 h(PMA組)；用無血清培養(yǎng)基洗1次，加入[3H]-膽固醇(終濃度為0.5 μCi/mL)和ac-LDL(終濃度為50 μg/mL)，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h(ac-LDL組)；加入無血清培養(yǎng)基平衡24 h后，加入含apoA-1的1640培養(yǎng)基(apoA-1終濃度為10 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h(apoA-1組)。同時(shí)設(shè)泡沫細(xì)胞對照組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。收集細(xì)胞培養(yǎng)基，置-20 ℃保存。用無血清1640培養(yǎng)基漂洗1次，每孔加入0.1 mol/L NaOH溶液500 μL，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，室溫靜置5 min，收集細(xì)胞裂解液至1.5 mL離心管中，-20 ℃保存。液體閃爍計(jì)數(shù)法測定培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解液中的放射強(qiáng)度，放射強(qiáng)度以cpm值計(jì)(cpm值為[3H]-膽固醇放射強(qiáng)度每分鐘計(jì)數(shù))。apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞膽固醇流出率按下列公式計(jì)算：膽固醇流出率(%) = 培養(yǎng)基內(nèi)cpm/(細(xì)胞內(nèi)cpm + 培養(yǎng)基中cpm)×100。

2 結(jié) 果

2.1 油紅O染色鑒定巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型 正常培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞呈單個(gè)懸浮培養(yǎng)或簇狀成團(tuán)，經(jīng)PMA作用24 h，細(xì)胞誘導(dǎo)為貼壁巨噬細(xì)胞，并分化出偽足(圖1 A)。進(jìn)一步用ac-LDL誘導(dǎo)48 h后，貼壁巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。經(jīng)油紅O染色，細(xì)胞內(nèi)可明顯觀察到大量紅色脂滴存在，胞漿呈現(xiàn)泡沫樣改變(圖1 B)，提示THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型成功建立。

A：PMA組；B：ac-LDL組。

圖1 THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞油紅O染色(×200)

2.2 測定膽固醇酯水平鑒定巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型 PMA組和ac-LDL組細(xì)胞分別用0.1% TritonX-100裂解后，經(jīng)膽固醇氧化酶和膽固醇酯酶的催化作用，細(xì)胞中的膽固醇全部轉(zhuǎn)化為膽甾烯酮。以標(biāo)準(zhǔn)膽甾烯酮作為外標(biāo)，HPLC法檢測細(xì)胞裂解液內(nèi)膽甾烯酮水平，標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞裂解液的色譜圖見圖2。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品膽甾烯酮峰面積、濃度和所測樣品峰面積、蛋白濃度，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)FC、TC和CE的水平，結(jié)果見表1。與PMA組相比，ac-LDL組細(xì)胞內(nèi)FC、TC和CE水平明顯高于PMA組(P<0.01)。PMA組CE水平為(8.95±0.67) μg/mg細(xì)胞蛋白，占TC的35.31%；ac-LDL組CE水平為(47.65±2.13) μg/mg細(xì)胞蛋白，占TC的59.38%。ac-LDL組CE的水平符合泡沫細(xì)胞CE應(yīng)占細(xì)胞TC 50%以上的特征，提示泡沫細(xì)胞模型成功建立。

表1 THP-1巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平

A：膽甾烯酮標(biāo)準(zhǔn)品；B：PMA組；C：ac-LDL組。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和不同處理組細(xì)胞內(nèi)膽甾烯酮色譜圖

2.3 HPLC法測定apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞膽固醇流出 收集ac-LDL組和apoA-1組的培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解上清液，酶促反應(yīng)結(jié)合HPLC法測定培養(yǎng)基中的FC水平和細(xì)胞內(nèi)的TC水平，見表2。根據(jù)培養(yǎng)基中FC和細(xì)胞內(nèi)TC水平，計(jì)算apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，泡沫細(xì)胞膽固醇流出率為(1.70±0.11)%，加入10 μg/mL apoA-1作用24 h后，泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率為(5.63±0.34)%，與ac-LDL組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3，提示apoA-1可明顯介導(dǎo)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出。

表2 細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中的膽固醇水平

*：P<0.01，與ac-LDL組比較。

圖3 HPLC法測定泡沫細(xì)胞膽固醇流出率

2.4 液體閃爍計(jì)數(shù)法測定apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞膽固醇流出 為評價(jià)HPLC法測定泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率的可行性，進(jìn)一步采用液體閃爍計(jì)數(shù)法測定apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率。收集apoA-1組和ac-LDL組的培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解上清液，液體閃爍計(jì)數(shù)儀測定培養(yǎng)基和細(xì)胞的cpm值，見表3。根據(jù)培養(yǎng)基和細(xì)胞的cpm值，計(jì)算apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入apoA-1后可明顯介導(dǎo)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，流出率為(7.08±0.30)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。該結(jié)果與上述HPLC法測定的結(jié)果接近，說明本實(shí)驗(yàn)所建立的酶促反應(yīng)結(jié)合HPLC法測定泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率的方法是可行的。

表3 細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中的cpm值

圖4 液體閃爍計(jì)算法測定泡沫細(xì)胞膽固醇流出率

3 討 論

泡沫細(xì)胞形成是AS的早期特征性病理性改變，貫穿于AS的整個(gè)過程，目前AS的機(jī)制尚未完全清楚，建立穩(wěn)定可靠的泡沫細(xì)胞模型對研究AS意義重大。要研究AS的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，常借助于實(shí)驗(yàn)性動物模型或細(xì)胞模型，相比于兔、小鼠、大鼠等動物模型[10-12]，細(xì)胞模型更為常用，如人單核THP-1細(xì)胞、U937細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞以及人HepG2細(xì)胞和J744巨噬細(xì)胞等[13-15]。本實(shí)驗(yàn)中，選用人單核細(xì)胞THP-1建立泡沫細(xì)胞模型，首先使用PMA誘導(dǎo)懸浮生長的THP-1細(xì)胞分化為貼壁生長的巨噬細(xì)胞，之后再加入ac-LDL共同孵育使貼壁巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分化為泡沫細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)建立該模型時(shí)PMA誘導(dǎo)分化較為關(guān)鍵，使用160 nmol/L PMA作用24～48 h可使巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)的能力增強(qiáng)，有利于巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成。泡沫細(xì)胞的生物學(xué)特征包括兩個(gè)方面：(1)形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為胞漿內(nèi)脂質(zhì)成分明顯增多并聚集成滴，經(jīng)油紅O染色可觀察到紅色脂滴，胞漿呈泡沫樣改變；(2)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平明顯增加，膽固醇酯占總膽固醇的50%以上。本實(shí)驗(yàn)從這兩方面對建立的泡沫細(xì)胞模型進(jìn)行鑒定，油紅O染色后顯微鏡下可觀察到ac-LDL組胞質(zhì)內(nèi)有大量紅色脂滴形成，胞漿呈泡沫樣改變，證實(shí)泡沫細(xì)胞模型構(gòu)建成功。油紅O染色過程中，先用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定10 min，之后再用50%異丙醇固定5 min效果較好，若直接用50%異丙醇固定細(xì)胞會出現(xiàn)脫落、漂浮。0.5%油紅O染色、異丙醇漂洗、蘇木素復(fù)染后不需再用1% HCl反藍(lán)，用自來水沖洗一段時(shí)間即可，否則紅色脂滴可能會消失。

計(jì)算細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯與總膽固醇的比值即可分析細(xì)胞的泡沫化程度，早期國內(nèi)外學(xué)者采用化學(xué)顯色法測定細(xì)胞游離膽固醇和膽固醇酯的水平，但檢測的靈敏度低是其主要缺陷。近年來研究者多采用HPLC法分析細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和膽固醇酯[16]，HPLC法由于具有高速、高效、高靈敏度等優(yōu)勢而被廣泛使用[17]，但目前在測定膽固醇水平中的不足是：(1)測定細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇水平時(shí)，以膽固醇作為標(biāo)準(zhǔn)品，測定210 nm波長的光吸收，而其他的細(xì)胞成分和流動相在此波長會有吸收而影響測定結(jié)果。(2)由于細(xì)胞內(nèi)某些膽固醇酯種類尚未完全清楚，缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，因而尚不能對細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯進(jìn)行精確定量。(3)現(xiàn)有的測定方法包括冰浴破碎細(xì)胞、依次經(jīng)過KOH、6%三氯乙酸、真空冷凍干燥、活性炭去色素、超聲除氣等實(shí)驗(yàn)步驟，操作繁瑣，不能滿足標(biāo)準(zhǔn)化操作要求?；诖?，本實(shí)驗(yàn)參考Cullen等[9]方法，改進(jìn)以上不足，建立了一種新的采用HPLC法測定泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平和膽固醇流出率的方法。以膽固醇氧化產(chǎn)物膽甾烯酮作為標(biāo)準(zhǔn)品，簡化實(shí)驗(yàn)操作步驟，將酶促反應(yīng)和HPLC分析相結(jié)合，測定膽甾烯酮在240 nm波長處的光吸收，對泡沫細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和總膽固醇水平進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)中以膽甾烯酮作為標(biāo)準(zhǔn)品的優(yōu)點(diǎn)是，膽甾烯酮的最大光吸收波長是240 nm，而在此波長下細(xì)胞中其他組份和培養(yǎng)基對測定沒有干擾，檢測的靈敏度提高。酶促反應(yīng)的基本原理是：膽固醇酯在膽固醇酯酶的催化下水解為游離膽固醇，游離膽固醇在膽固醇氧化酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)槟戠尴┩@樣上樣檢測時(shí)只需檢測240 nm處膽甾烯酮的峰面積即可。根據(jù)膽甾烯酮的峰面積和上樣量，即可計(jì)算出游離膽固醇和總膽固醇的水平。進(jìn)一步收集泡沫細(xì)胞培養(yǎng)基，提取脂質(zhì)后，加入膽固醇氧化酶進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定膽甾烯酮水平，計(jì)算培養(yǎng)基中的游離膽固醇水平，即可準(zhǔn)確定量apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率。為了摸索不同膽固醇酯類的水解作用和氧化作用的范圍，本研究進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇合適的試劑濃度和反應(yīng)條件，兩個(gè)酶促反應(yīng)都可完成，膽甾烯酮的最終濃度在數(shù)量上等于樣品中膽固醇的初始濃度。用這種方法測定細(xì)胞中總膽固醇和游離膽固醇的水平敏感而且快速，DAD檢測波長在240 nm處，得到單一的色譜峰，易于統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照PMA組相比，50 μg/mL ac-LDL處理48 h后，泡沫細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇、總膽固醇和膽固醇酯的水平均明顯增加，且細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯占總膽固醇的59.38%，進(jìn)一步證實(shí)成功建立了泡沫細(xì)胞模型，而且apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率也顯著增加(P<0.01)。

為評價(jià)本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC法測定泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率的可行性，進(jìn)一步采用液體閃爍計(jì)數(shù)法測定apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率，以對該法進(jìn)行驗(yàn)證。液體閃爍計(jì)算法用[3H]標(biāo)記的膽固醇作為標(biāo)準(zhǔn)，分別測定培養(yǎng)基和泡沫細(xì)胞內(nèi)[3H]標(biāo)記的膽固醇放射劑量cpm，以培養(yǎng)基中的cpm占培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)的總cpm來表示[18]。實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)分化的貼壁巨噬細(xì)胞用0.5 μCi/mL[3H]-膽固醇和50 μg/mL ac-LDL共同孵育48 h，轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。當(dāng)用10 μg/mL apoA-1介導(dǎo)24 h后，泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率從2.08 %上升至7.08%，增加率為240.38%。盡管同位素測定方法的靈敏度高，但由于其對實(shí)驗(yàn)要求較高，且同位素易對環(huán)境造成污染，為此需建立一種具有較高靈敏度的非同位素測定膽固醇流出率的方法。本實(shí)驗(yàn)采用酶促反應(yīng)結(jié)合HPLC方法測定的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的增加率為231.18%，與液體閃爍計(jì)數(shù)法測定的膽固醇流出增加率具有可比性，進(jìn)一步證實(shí)了其可行性。該方法的建立為研究AS的致病機(jī)制、開發(fā)新的抗AS藥物及評價(jià)藥效提供了技術(shù)支持。

[1]De Boer SP,Cheng JM,Rangé H,et al.Antibodies to periodontal pathogens are associated with coronary plaque remodeling but not with vulnerability or burden[J].Atherosclerosis,2014,237(1):84-91.

[2]Libby P,Ridker PM,Hansson GK.Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis[J].Nature,2011,473(7347):317-325.

[3]Yuan Y,Li P,Ye J.Lipid homeostasis and the formation of macrophage-derived foam cells in atherosclerosis[J].Protein Cell,2012,3(3):173-181.

[4]Beaufrère H,Nevarez JG,Wakamatsu N,et al.Experimental diet-induced atherosclerosis in Quaker parrots (Myiopsitta monachus)[J].Vet Pathol,2013,50(6):1116-1126.

[5]Calabresi L,Gomaraschi M,Simonelli S,et al.HDL and atherosclerosis:Insights from inherited HDL disorders[J].Biochim Biophys Acta,2015,1851(1):13-18.

[6]Breevoort SR,Angdisen J,Schulman IG.Macrophage-independent regulation of reverse cholesterol transport by liver X receptors[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2014,34(8):1650-1660.

[7]Schmitz G,Grandl M.The molecular mechanisms of HDL and associated vesicular trafficking mechanisms to mediate cellular lipid homeostasis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2009,29(11):1718-1722.

[8]Lund-Katz S,Phillips MC.High density lipoprotein structure-function and role in reverse cholesterol transport[J].Subcell Biochem,2010(51):183-227.

[9]Cullen P,Fobker M,Tegelkamp K,et al.An improved method for quantification of cholesterol and cholesteryl esters in human monocyte-derived macrophages by high performance liquid chromatography with identification of unassigned cholesteryl ester species by means of secondary ion mass spectrometry[J].J Lipid Res,1997,38(2):401-409.

[10]Shiomi M,Koike T,Ito T.Contribution of the WHHL rabbit,an animal model of familial hypercholesterolemia,to elucidation of the anti-atherosclerotic effects of statins[J].Atherosclerosis,2013,231(1):39-47.

[11]Hasan ST,Zingg JM,Kwan P,et al.Curcumin modulation of high fat diet-induced atherosclerosis and steatohepatosis in LDL receptor deficient mice[J].Atherosclerosis,2014,232(1):40-51.

[12]郝炎，楊喬嵐，余翼，等．腎動脈狹窄合并動脈粥樣硬化大鼠模型的建立[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2012，41(6)：581-583．

[13]Liu HJ,Wang XL,Zhang L,et al.Inhibitions of vascular endothelial growth factor expression and foam cell formation by EGb 761,a special extract of Ginkgo biloba,in oxidatively modified low-density lipoprotein-induced human THP-1 monocytes cells[J].Phytomedicine,2009,16(2/3):138-145.

[14]Sato K,Fujimoto K,Koyama T,et al.Release of salusin-beta from human monocytes/macrophages[J].Regul Pept,2010,162(1/3):68-72.

[15]Liu Q,Dai Z,Liu Z,et al.Oxidized low-density lipoprotein activates adipophilin through ERK1/2 signal pathway in RAW264.7 cells[J].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2010,42(9):635-645.

[16]李國術(shù)，何平平，王波，等．硫化氫上調(diào)ABCA1表達(dá)促進(jìn)泡沫細(xì)胞膽固醇流出的實(shí)驗(yàn)研究[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2013，42(30)：3596-3598．

[17]陳保林，馬躍東，熊肇軍，等．高效液相色譜法檢測心肌細(xì)胞蛋白降解率[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2011，40(22)：2234-2235．

[18]Lin G,Bornfeldt KE.Cyclic AMP-specific phosphodiesterase 4 inhibitors promote ABCA1 expression and cholesterol efflux[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,290(2):663-669.

Research on the determination of cholesterol efflux from foam cells mediated by apoA-1 using HPLC analysis*

MaWeilie1,GongXiaohua1,LiGuanqiang2,DingHang1,LanLiubo1,ChenXiaoyi1,ZhangZhizhen1△

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuangdongMedicalCollege,Dongguan,Guangdong523808,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofLonggangDistrict,Shenzhen,Guangdong518172,China)

ObjectiveTo establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for determining the cholesterol efflux from macrophage-derived foam cells mediated by apolipoprotein A-1(apoA-1).MethodsHuman THP-1 monocytic cells,pre-treated with 160 nmol/L phorbol-12-myristate acetate (PMA) for 24 h to differentiate into adherence macrophages,then incubated with 50 μg/mL acetylated low density lipoprotein (ac-LDL) for 48 h to induce foam cells formation,then added apoA-1 for 24 h.THP-1-derived macrophage foam cells were identified by oil red O-staining,and the cellular cholesterol content by measured by HPLC method.Cholesterol efflux from macrophage foam cells was determined by HPLC analysis and liquid scintillation counting,respectively.ResultsOil red O-stainable lipid droplet accumulation were observed in entire cytoplasm of THP-1-derived macrophage foam cells.Measuring cellular cholesterol content showed that free cholesterol,total cholesterol and cholesterol ester content in macrophage foam cells were increased remarkably than PMA group macrophages (P<0.01).After treated with ac-LDL for 48 h,the macrophage foam cells accumulated 80.25 μg/mg cell protein and 47.65 μg/mg cell protein respectively,and the cholesterol ester accounted for 59.38% of the cellular total cholesterol (P<0.01).The ratio of cholesterol efflux reached 5.63% and 7.08% respectively by HPLC analysis and liquid scintillation counting using apoA-1 mediation (P<0.01).ConclusionCombination of an enzymatic catalysis and HPLC method for determining cholesterol efflux from foam cells is successfully established in this study,thus providing a technical foundation for the further study of cellular lipid homeostasis.

chromatography,high pressure liquid；foam cells；apolipoprotein A-1；cholestenone；cholesterol efflux

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.028

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170267)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(S2011010002984)；東莞市高等院?？蒲袡C(jī)構(gòu)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012108102037)。

：馬衛(wèi)列(1970-)，碩士，副教授，主要從事脂質(zhì)代謝研究?！?/p>

，Tel:(0769)22896339;E-mail:zzzhang@gdmc.edu.cn。

Q54

A

1671-8348(2015)29-4116-04

2015-04-15

2015-07-02)