董 靜,陳 萍,劉 丹,呂艷欣,梅慶步,張明龍,鄭立紅
(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物遺傳教研室,黑龍江齊齊哈爾 161000)
論著·臨床研究
白細(xì)胞介素基因多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)性分析*
董 靜,陳 萍,劉 丹,呂艷欣,梅慶步,張明龍,鄭立紅△
(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物遺傳教研室,黑龍江齊齊哈爾 161000)
目的探討白細(xì)胞介素-10(IL-10)基因多態(tài)性(SNPs)與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)性。方法采集齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附院乳腺癌患者血樣156例作為病例組,抽取健康者血樣156例作為對照組。經(jīng)過基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增等一系列反應(yīng),使用時間飛行質(zhì)譜對IL-10-592、-1082位點(diǎn)進(jìn)行基因分型及多態(tài)性分析。最終通過統(tǒng)計學(xué)分析乳腺癌患者與健康者之間的差異。結(jié)果兩組的IL-10-592位點(diǎn)均存在C/C、C/A、A/A 3種基因型,比較分布不存在顯著差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.26,P>0.05)。兩組的IL-10-1082位點(diǎn)均存在G/G、G/A、A/A基因型,比較分布存在差異,病例組G/G、G/A基因型多于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.07,P<0.01)。在Logistic多元回歸分析中發(fā)現(xiàn),與IL-10-592 A/A基因型比較,攜帶IL-10-592 C/A、C/C基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險性分別為OR=1.039(95%CI:0.484~2.233),P=0.922,OR:1.635(95%CI=0.683~3.915),P=0.270,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與IL-10-1082 A/A比較,表達(dá)IL-10-1082 G/A、G/G基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險性分別為OR=0.424(95%CI:0.210~0.855),P=0.016,OR=0.455(95%CI:0.178~1.163),P=0.100。結(jié)論IL-10-592 位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與乳腺癌遺傳易感不相關(guān)。IL-10-1082 G/A基因型的表達(dá)可能是乳腺癌遺傳易感的一個保護(hù)因素。
白細(xì)胞介素10;乳腺腫瘤;基因多態(tài)性
全球乳腺癌發(fā)病率較高,據(jù)國家癌癥中心和國家衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局統(tǒng)計顯示[1]:乳腺癌發(fā)病率已占據(jù)女性惡性腫瘤第一位,且各地區(qū)發(fā)病率無明顯差異[2]。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確,但根據(jù)多項調(diào)查發(fā)現(xiàn)遺傳、免疫等均為乳腺癌的高危因素[3]。歐美等國家通過大量研究發(fā)現(xiàn)大量乳腺癌相關(guān)的易感基因,如BRCA-1/2、p53、PTEN等[4]。本次研究選擇了乳腺癌患者白細(xì)胞介素-10(IL-10)啟動子區(qū)-592、-1082位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行研究,通過基因測序進(jìn)行統(tǒng)計分析,以論證IL-10基因多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感的關(guān)系。
1.1 一般資料 采集2013年1月至2014年6月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的乳腺癌患者血樣156例作為病例組,均為女性,平均年齡(45.73±7.69)歲。另采集同期體檢健康者血樣156例作為對照組,均為女性,平均年齡(43.91±7.16)歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)[5]及世界衛(wèi)生組織(WHO)[6]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定。病例組中乳腺癌患者均為首次發(fā)現(xiàn)就診,經(jīng)病理學(xué)診斷確診,排除其他腫瘤類疾病。對照組既往均無乳腺腫瘤及其他類腫瘤疾病。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取及引物制備 采集清晨空腹血1 mL,肝素抗凝,使用全血基因組小劑量試劑盒提取DNA后進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測及濃縮純化。根據(jù)IL-10的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn),用iPLEX GOLD設(shè)定IL-10-592(rs1800872)、IL-10、-1082(rs1800896)的引物。見表1。
1.2.2 PCR擴(kuò)增及單堿基延伸 使用7900PCR擴(kuò)增儀(ABI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系5.0 μL:MgCl2,0.5 μL,1×;底物混合物0.1 μL,2 mmol/L;引物混合物1.0 μL,100 nmol/L;反應(yīng)酶0.2 μL,1.0 U;水1.8 μL。循環(huán)參數(shù):94 ℃,900 s;94 ℃,20 s;56 ℃,30 s;72 ℃,60 s,45次循環(huán);72 ℃,180 s;4 ℃存放。按照iPLEX GOLD建議[7]進(jìn)行單堿基延伸。
表1 引物序列表
1.2.3 飛行質(zhì)譜基因分型[8]PCR的產(chǎn)物在單堿基延伸后收集純化的DNA,使用SCMS-IT-TOF飛行時間質(zhì)譜分析儀進(jìn)行基因表型分析,SEQUENOM軟件對單堿基延伸產(chǎn)物質(zhì)譜峰位置確定分子質(zhì)量,得出SNP分型結(jié)果,并根據(jù)質(zhì)譜峰的信噪比、峰尖位置、峰寬度判定分型結(jié)果質(zhì)量值。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,應(yīng)用χ2檢驗比較并分析基因型及等位基因分布。應(yīng)用Logistic多元回歸分析各基因型與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)性。檢驗水準(zhǔn)α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 基因型及頻率分布 經(jīng)分析兩組的IL-10-592位點(diǎn)均存在C/C、C/A、A/A 3種基因型,比較分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.26,P>0.05)。兩組的IL-10-1082位點(diǎn)均存在G/G、G/A、A/A基因型,病例組G/G、G/A基因型多于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.07,P<0.01),見表2。
表2 基因型及頻率分布[n(%)]
2.2 基因型頻率Hardy-Weinberg平衡檢驗 本研究中所得的實(shí)際值,與預(yù)測值進(jìn)行比較,經(jīng)χ2檢驗病例組與對照組中各基因型實(shí)際值與預(yù)測值分布不存在差異(P>0.05),僅病例組中IL-10-1082位點(diǎn)基因型分布存在差異(P<0.05),基本符合Hardy-Weinberg 平衡,證實(shí)了本研究的群體符合遺傳學(xué)規(guī)律,具有代表性,見表3、表4。
2.3 各基因位點(diǎn)與乳腺癌遺傳易感相關(guān)性分析 對本研究中所得結(jié)果使用Logistic多元回歸分析,以驗證IL-10-592與IL-10-1082各位點(diǎn)與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)性。與IL-10-592 A/A基因型比較,表達(dá)IL-10-592 C/A、C/C基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險性分別為OR=1.039,95%CI:0.484~2.233,P=0.922,OR=1.635,95%CI:0.683~3.915,P=0.270,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與IL-10-1 082 A/A比較,表達(dá)IL-10-1082 G/A、G/G基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險性分別為OR=0.424,95%CI:0.210~0.855,P=0.016,OR=0.455,95%CI:0.178~1.163,P=0.100。即IL-10-1082 G/A基因型表達(dá)可能降低乳腺癌發(fā)病的風(fēng)險,見表5、6。
表3 IL-10-592位點(diǎn)基因型頻率平衡檢驗
表4 IL-10-1 082位點(diǎn)基因型頻率平衡檢驗
表5 IL-10-592 位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感的危險性分析
表6 IL-10-1082 位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感的危險性分析
乳腺癌作為全球高發(fā)的一類惡性腫瘤,其發(fā)病與遺傳、環(huán)境等因素關(guān)系密切,但其發(fā)病的分子機(jī)制尚未確切,對于細(xì)胞因子基因多態(tài)性的研究逐漸深入。IL-10屬于干擾素家族的細(xì)胞因子合成抑制因子,它可抑制Th1細(xì)胞合成干擾素-γ、TNF-α等[9-10]。其是一種具有免疫活力的免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)因子,具有刺激、抑制免疫的雙重作用[11-12]。其可增強(qiáng)B細(xì)胞的增殖、分化,上調(diào)MHC-Ⅱ的表達(dá),也可以抑制單核細(xì)胞MHC-Ⅱ的表達(dá),下調(diào)T細(xì)胞活性。由于作用的靶細(xì)胞不同,IL-10表現(xiàn)出不同的效用,其雙向表現(xiàn)是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵[13-14]。IL-10啟動子區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子,影響其水平的表達(dá),因此啟動子區(qū)基因多態(tài)性的研究是目前基礎(chǔ)研究的熱門[15-16]。
國內(nèi)外對于白細(xì)胞介素的研究眾多。方琦[17]在對原發(fā)性乳腺癌組織中IL-8的基因表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)IL-8相對表達(dá)高時乳腺癌患者生存期較短,且IL-8表達(dá)可能為乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險因素。劉繼永[18]發(fā)現(xiàn)IL-1B T-31C、C-511T的多態(tài)性改變可能會增加中國人群乳腺癌發(fā)病概率,在其多層分析中也發(fā)現(xiàn)月經(jīng)情況可能影響IL-8基因多態(tài)性與乳腺癌易感的關(guān)聯(lián)。宋新宇等[19]研究中發(fā)現(xiàn)IL-10可能通過抑制樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)生及分化而抑制機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫作用。有文獻(xiàn)證實(shí)了IL-10在協(xié)助乳腺癌細(xì)胞逃脫免疫攻擊上可能起著重要作用[20]。相反的是,Smith等[21]研究闡述IL-10等細(xì)胞因子與乳腺癌的易感性無明顯關(guān)系。且張國強(qiáng)等[22]的Meta分析未能證明IL-10基因多態(tài)性與乳腺癌易感相關(guān)。
3.1 IL-10-592位點(diǎn)多態(tài)性分析 本研究中,分析結(jié)果顯示,在病例組中IL-10-592 C/C、C/A、A/A位點(diǎn)各基因型頻率分別為28.2%、50.0%、21.8%,與對照組比較無顯著差異,不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在Logistic多元回歸分析中發(fā)現(xiàn),與IL-10-592 A/A基因型比較,表達(dá)IL-10-592 C/A、C/C基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險性分別為OR=1.039,OR=1.635,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。即細(xì)胞因子IL-10-592 位點(diǎn)多態(tài)性的改變可能與乳腺癌的易感不相關(guān)。而在相關(guān)研究領(lǐng)域中,Cheong等[23]發(fā)現(xiàn)IL-10啟動子區(qū)-592 A等位基因與乙型肝炎易感可能相關(guān)。
3.2 IL-10-1082位點(diǎn)多態(tài)性分析 IL-10-1082位點(diǎn)多態(tài)性在乳腺癌患者與健康人群中分布各異,Giordani等[24]及Gonullu等[25]研究發(fā)現(xiàn)IL-10-1082位點(diǎn)的多態(tài)性與乳腺癌易感性相關(guān),在病例組各基因型頻率與對照組比較,病例組G/G、G/A基因型多于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在Logistic多元回歸分析中發(fā)現(xiàn),與IL-10-1082 A/A比較,表達(dá)IL-10-1082 G/A、G/G基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險性分別為OR=0.424,P=0.016,OR=0.455,P=0.100。表達(dá)IL-10-1082 G/A基因型患乳腺癌的概率是A/A基因型群體的0.424倍,G/A基因型為乳腺癌遺傳易感的保護(hù)因素,可以降低患乳腺癌的風(fēng)險,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。即細(xì)胞因子IL-10-1082 G/G基因型表達(dá)可能與乳腺癌易感不相關(guān),而IL-10-1082 G/A基因型表達(dá)可能降低乳腺癌發(fā)病的風(fēng)險。而Smith等[21]及Balasubramanian等[26]等研究結(jié)果卻相反,他們發(fā)現(xiàn)該類細(xì)胞因子與乳腺癌易感性無明顯關(guān)系。
綜上,本研究中并不能證明IL-10基因多態(tài)性的改變與乳腺癌遺傳易感相關(guān),但I(xiàn)L-10-1082 G/A基因型表達(dá)可能是乳腺癌發(fā)病的一個保護(hù)因素,這與既往IL-10-1082 G/A基因多態(tài)性在乳腺癌的易感性方面扮演某種角色的說法[27-28]相印證,而與張國強(qiáng)等[22]的Meta分析中的結(jié)果相悖。對于白細(xì)胞介素與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)研究相對較少,樣本量較小也可能影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確度,對于二者的相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。
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Analysis of the relationship between interleukin SNPs and breast cancer susceptibility*
DongJing,ChenPing,LiuDan,LvYanxin,MeiQingbu,ZhangMinglong,ZhengLihong△
(DepartmentofBiologicalHeredity,QiqiHaerMedicalUniversity,QiqiHaer,Heilongjiang161000,China)
ObjectiveTo investigate the relationship between IL-10 SNPs and breast cancer susceptibility.MethodsCollected 156 blood samples of breast cancer patients as case group and 156 blood samples of health as control.Genotype SNPs of IL-10-592,-1082 were analyzed by genomic DNA extraction,PCR amplification and TOF mass spectrometry.The data was used by statistical analysis.ResultsIL-10-592 C/C,C/A and A/A site the genotype frequencies were not diversity between two groups(χ2=3.26,P>0.05).IL-10-1082 G/G、G/A、A/A site the genotype frequencies were statistically significant between two groups(χ2=14.07,P<0.01).In Logistic multivariate regression analysis found that:be compared with IL-10-592 A/A,carrying IL-10-592 C/A,C/C group respectively the risk of breast cancer wereOR=1.039(95%CI:0.484-2.233),P=0.922,OR=1.635(95%CI:0.683-3.915),P=0.270,which had no statistical significance.In Logistic multivariate regression analysis found that:be compared with IL-10-1082 A/A,carrying IL-10-1082 G/A、G/G group respectively the risk of breast cancer wereOR=0.424(95%CI:0.210-0.855),P=0.016,OR=0.455(95%CI:0.178-1.163),P=0.100.ConclusionIL-10-592 may be not associated with breast cancer susceptibility.IL-10-1082 G/A may be a protection factor with breast cancer susceptibility.
interleukin-10;breast neoplasms;gene polymorphism
10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.019
黑龍江省教育廳面上項目(12541903)。
:董靜(1987-),碩士,助教,主要從事抗腫瘤研究。△
,Tel:18045289390;E-mail:zhenglihong0zlh@sina.com。
R737.9
A
1671-8348(2015)29-4086-03
2015-04-18
2015-08-16)