申淑珍，劉 娟，馬 云，楊 瑞，許 飛，李 玲，白曉川

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液科，銀川 750004)

論著·臨床研究

CDX2基因在成人急性髓細(xì)胞白血病中的表達(dá)及臨床意義*

申淑珍，劉 娟，馬 云，楊 瑞，許 飛，李 玲，白曉川

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液科，銀川 750004)

目的研究尾型同源盒基因2(CDX2)在急性髓細(xì)胞白血病(AML)患者中的表達(dá)及臨床意義。方法通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)114例初發(fā)AML患者及56例誘導(dǎo)化療后患者骨髓和(或)外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞CDX2基因表達(dá)，19例隨訪(fǎng)患者每3個(gè)月定期檢測(cè)CDX2基因表達(dá)。8名健康者外周靜脈血和5名缺鐵性貧血患者骨髓作為對(duì)照。結(jié)果114例AML患者和13名對(duì)照的骨髓和(或)外周血單個(gè)核細(xì)胞均檢測(cè)到CDX2基因表達(dá)。以第一個(gè)四分位數(shù)為界劃分低表達(dá)組和高表達(dá)組，對(duì)照組CDX2基因表達(dá)水平均在低表達(dá)組，114例AML患者高表達(dá)組90例(78.9%)，對(duì)照組與AML患者CDX2基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。初發(fā)患者骨髓和外周靜脈血CDX2基因表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.656,P<0.01)。CDX2高低表達(dá)組誘導(dǎo)化療完全緩解(CR)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本組AML病例CDX2高表達(dá)78.9%。CR患者CDX2表達(dá)量為化療前的10.3%～86.2%，且隨著療程增加逐步降低，復(fù)發(fā)時(shí)顯著升高。隨訪(fǎng)6個(gè)月以上病例19例，兩組早期復(fù)發(fā)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論CDX2表達(dá)量變化反映患者體內(nèi)白血病細(xì)胞負(fù)荷，持續(xù)高表達(dá)可能是預(yù)后不良指標(biāo)之一，可作為染色體核型正常AML微小殘留病監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

CDX2；白血病，髓細(xì)胞，急性；預(yù)后；微小殘留白血病

尾型同源盒基因2(CDX2)在急性髓細(xì)胞白血病(AML)中表達(dá)最早是Chase等[1]1999年報(bào)道的，同時(shí)提示CDX2基因在白血病中的表達(dá)可能參與了白血病的發(fā)生。Scholl等[2]研究提示成人白血病中存在胚胎通路的激活，CDX2是同源盒基因(HOX)家族成員，是促進(jìn)胚胎發(fā)育和早期造血發(fā)育的主控基因，通過(guò)胚胎通路的激活,導(dǎo)致成人急性白血病。在AML發(fā)病中起的是原癌基因的作用，CDX2基因表達(dá)上調(diào)后通過(guò)增強(qiáng)造血祖細(xì)胞的自我更新能力而使細(xì)胞獲得了潛在的致白血病性。本文通過(guò)檢測(cè)初發(fā)及誘導(dǎo)化療后AML患者骨髓及(或)外周靜脈血中CDX2表達(dá)，19例AML(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)隨訪(fǎng)超過(guò)6個(gè)月，每3個(gè)月檢測(cè)骨髓和(或)外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞CDX2基因表達(dá)。探討其與AML患者臨床及預(yù)后、微小殘留白血病(MRD)的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集2011年8月至2014年8月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液科住院患者，經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)及組織化學(xué)、免疫表型檢查確診初治 AML 患者 114例,診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)張之南等[3]的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。男76 例,女38 例,年齡16～78歲,就診平均年齡43.9歲。完成常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)方案(TA或IA)化療1個(gè)周期可供療效評(píng)估。對(duì)照為8名身體健康血液科工作人員外周靜脈血和5名缺鐵性貧血(IDA)患者骨髓。隨訪(fǎng)截止2014年12月。

1.2 主要試劑和儀器 TRIzol、PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)和Premix EX Taq(Perfect Real Time) (大連TaKaRa生物工程公司)，ABI7300熒光定量PCR儀(ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)和合成 基因序列從GenBank中獲取，引物用Primer5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。由上海閃晶生物技術(shù)有限公司合成。CDX2基因上游引物5′-TTC AGA ACC GCA GAG CAA AG-3′，下游引物5′-CCC AGG GAC AGA GCC AGA C-3′；內(nèi)參基因GAPDH上游引物5′-CCA TGT TCG TCA TGG GTG TGA ACC A-3′，下游引物5′-GCC AGT AGA GGC AGG GAT GAT GTT C-3′。

1.3.2 單個(gè)核細(xì)胞提取 采集患者和對(duì)照者骨髓、靜脈血，EDTA抗凝，加入淋巴細(xì)胞分離液，按說(shuō)明書(shū)分離并收集單個(gè)核細(xì)胞。

1.3.3 RNA提取和cDNA合成 提取患者和對(duì)照骨髓及全血的單個(gè)核細(xì)胞用Trizol試劑，按說(shuō)明書(shū)所附提取步驟提取mRNA，用微量分光光度計(jì)(NanoDrop,Thermo)定量,OD260/280比值在1.8～2.0,于-80 ℃保存。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)?？傮w系20 μL：2×RTmix液10 μL，模板RNA 100～500 ng,加RNase free水至總體積20 μL；反應(yīng)條件：37 ℃ 16 min，85 ℃ 5 s。

1.3.4 RT-PCR 所有基因RT-PCR按照試劑盒配制定量PCR反應(yīng)體系。在20 μL反應(yīng)體系中含2×PCR Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL(2.5 μmol/L),RoxⅡ 0.4 μL,cDNA反應(yīng)產(chǎn)物2 μL,加入RNasefree水補(bǔ)足至20 μL。在ABI 7500 Fast上進(jìn)行定量反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s變性,95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s,50個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值用于結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

1.3.5 基因mRNA表達(dá)水平相對(duì)定量與分析 反應(yīng)結(jié)束后，ABI7300 SDS Software自動(dòng)分析熒光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換Ct值。Ct值取3個(gè)復(fù)管的平均值?！鰿t為目的基因Ct值與內(nèi)參Ct值的差值。

1.3.6 CDX2基因表達(dá)水平的計(jì)算方法 CDX2基因表達(dá)量=2-△△Ct(△△Ct=△Ct患者-△Ct健康對(duì)照)×107。

1.3.7 CDX2基因表達(dá)四分位數(shù)劃分 CDX2基因表達(dá)量根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)中四分位數(shù)Q1,Q2和Q3結(jié)合健康人表達(dá)水平來(lái)劃分高低表達(dá)組,低于Q1的為低表達(dá)組,>Q1的為高表達(dá)組。

2 結(jié) 果

2.1 CDX2基因表達(dá)情況 114例AML患者血和骨髓及對(duì)照組骨髓或靜脈血均檢測(cè)到CDX2基因表達(dá)，114例AML患者骨髓中位表達(dá)水平為620.02(1.17～5 672 670.61)，血中位表達(dá)水平為647.33(3.22～8 213 486.54)，骨髓和血CDX2基因表達(dá)具有正相關(guān)(r=0.656,P<0.01)。對(duì)照組CDX2基因mRNA表達(dá)水平相對(duì)定量與AML CDX2基因mRNA表達(dá)水平相對(duì)定量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 CDX2基因表達(dá)與臨床特征相關(guān)性 114例AML患者骨髓低表達(dá)組24例(表達(dá)范圍1.17～175.19)，高表達(dá)組90例(175.19～5 672 670.61)，占AML病例78.9%。男性患者高表達(dá)81.6%，女性患者高表達(dá)73.7%，年齡大于或等于60歲組高表達(dá)87.0%，<60歲組高表達(dá)76.9%，白細(xì)胞數(shù)大于或等于30×109/L組高表達(dá)85.0%，白細(xì)胞數(shù)小于30×109/L組高表達(dá)75.7%，乳酸脫氫酶大于或等于1 000 U/L組高表達(dá)82.2%，乳酸脫氫酶小于1 000 U/L組高表達(dá)76.8%，免疫表型CD34+的病例組高表達(dá)72.0%，CD34-的病例組高表達(dá)92.3%，CD7+病例組高表達(dá)83.0%，CD7-病例組高表達(dá)70.2%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在FAB分型中高表達(dá)分別為AML-M0 100%，AML-M1 89.3%，AML-M2 65.5%，AML-M3 25.0%，AML-M4 78.6%，AML-M5 84.6%，AML-M6 100%，淋髓混合病例高表達(dá)100%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。染色體正常核型組高表達(dá)78.3%，預(yù)后良好核型組高表達(dá)55.0%，預(yù)后不良核型組高表達(dá)90.9%，其他核型組高表達(dá)81.8%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 CDX2表達(dá)與誘導(dǎo)緩解率的關(guān)系 114例AML患者中有56例(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)完成誘導(dǎo)化療，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)完全緩解(CR)37例，其中CDX2低表達(dá)11例(29.7%)，CDX2高表達(dá)26例(70.3%)；骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)未緩解(NR) 19例，其中CDX2低表達(dá)3例(15.8%)，CDX2高表達(dá)16例(84.2%)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 AML患者CDX2基因表達(dá)與臨床特征、治療反應(yīng)相關(guān)性[n(%)]

續(xù)表1 AML患者CDX2基因表達(dá)與臨床特征、治療反應(yīng)相關(guān)性[n(%)]

2.4 誘導(dǎo)化療前后CDX2表達(dá)變化 37例誘導(dǎo)化療達(dá)CR病例CDX2表達(dá)較化療前均有不同程度降低，化療后CDX2表達(dá)量為化療前的10.3%～86.2%；19例誘導(dǎo)化療NR病例中，CDX2表達(dá)量較化療前有不同程度升高6例，余13例CDX2表達(dá)較化療前不同程度降低。

2.5 隨訪(fǎng)病例治療過(guò)程中CDX2表達(dá)變化 隨訪(fǎng)6個(gè)月以上病例19例，其中CDX2高表達(dá)15例，誘導(dǎo)化療1個(gè)療程達(dá)CR 12例，誘導(dǎo)化療2個(gè)療程達(dá)CR 3例。CDX2低表達(dá)2例誘導(dǎo)化療1個(gè)療程達(dá)CR。CR后CDX2表達(dá)量隨化療療程次數(shù)增加逐步下降，復(fù)發(fā)時(shí)再次顯著升高，且有2例隨訪(fǎng)超過(guò)2年復(fù)發(fā)病例，CDX2升高早于FCM檢測(cè)MRD及骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)。持續(xù)不緩解2例，CDX2表達(dá)量逐步升高，死亡前CDX2表達(dá)量分別是初發(fā)時(shí)的60倍及100余倍。

3 討 論

AML是高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)腫瘤，影響預(yù)后的因素包括臨床特點(diǎn)、白血病類(lèi)型、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及治療反應(yīng)、微小殘留等。MRD的檢測(cè)對(duì)患者的再評(píng)估及危險(xiǎn)度再分層至關(guān)重要[4]。監(jiān)測(cè)MRD的方法主要有PCR、流式細(xì)胞免疫分析(FCM)及FISH。其中定量PCR通過(guò)檢測(cè)白血病細(xì)胞中標(biāo)志性基因?qū)崟r(shí)觀測(cè)MRD，靈敏度可達(dá)10-6，且費(fèi)用顯著低于FCM及FISH的檢測(cè)費(fèi)用,但基因定量需要患者有特異性基因標(biāo)記。約60%的AML患者有核型異常，預(yù)后良好的核型t(15;17)形成的PML/RARa融合基因、t(8;21)形成的AML1/ETO融合基因、inv(16)、t(16;16)形成的CBFB/MYH11融合基因，占成人AML患者25%；而對(duì)于t(8;21)合并del(9q)、-Y及復(fù)雜核型、MLLT4、MLLT10等均提示預(yù)后不良；約40%的AML患者為正常核型，近些年新發(fā)現(xiàn)的與AML預(yù)后相關(guān)分子生物學(xué)指標(biāo)如FLT3、NPM1、CEBPA、IDH等在正常核型AML患者中陽(yáng)性率分別為23%、50%、10%、15%[4]。新近研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)的急性白血病(AL)患者CDX2廣泛高表達(dá)，CDX2表達(dá)與AL患者白血病細(xì)胞負(fù)荷,MRD成正相關(guān)[5]。

本文通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)了初發(fā)成人AML患者(靜脈血和骨髓)及健康者靜脈血、IDA患者骨髓CDX2基因mRNA表達(dá)水平，均有表達(dá)，但健康者及IDA患者表達(dá)水平均低，與AML患者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。本組AML病例CDX2基因高表達(dá)78.9%。在以性別、年齡、FAB分型、白細(xì)胞、乳酸脫氫酶分組的CDX2高表達(dá)、低表達(dá)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與陸瀅等[6]研究相符。但CDX2基因在高白細(xì)胞數(shù)組高表達(dá)85.0%,乳酸脫氫酶大于或等于1 000 U/L組高表達(dá)82.2%，CD7+病例高表達(dá)83.0%；AML-M0 高表達(dá)100.0%，AML-M5 高表達(dá)84.6%，AML-M6 高表達(dá)100.0%，淋髓混合高表達(dá)100%，預(yù)后不良核型組高表達(dá)90.9%；而預(yù)后好的AML-M3高表達(dá)25.0%，預(yù)后良好核型組高表達(dá)55.0%。高白細(xì)胞、乳酸脫氫酶升高、FAB分型AML-M4、-M5、-M6、髓淋混合和染色體預(yù)后不良核型均是影響預(yù)后不良指標(biāo)。隨訪(fǎng)持續(xù)不緩解2例患者，CDX2表達(dá)逐步升高，死亡前CDX2表達(dá)量分別是初發(fā)時(shí)的60倍及100余倍。均提示CDX2高表達(dá)可能與白血病細(xì)胞高負(fù)荷和預(yù)后不良相關(guān)，還需更多的病例研究去證實(shí)。

本組病例統(tǒng)計(jì)顯示CDX2高表達(dá)不影響AML誘導(dǎo)緩解率及早期復(fù)發(fā)率，這與黎國(guó)偉等[7]研究結(jié)果相符?；熀驝R患者CDX2表達(dá)量較化療前均有不同程度降低，隨訪(fǎng)6個(gè)月以上病例19例，隨著化療療程增加CDX2表達(dá)逐步降低，復(fù)發(fā)時(shí)顯著升高。有2例隨訪(fǎng)超過(guò)2年復(fù)發(fā)病例，CDX2基因表達(dá)量升高早于流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)白血病微小殘留及骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)，且染色體正常核型組CDX2高表達(dá)78.3%。提示可和FCM監(jiān)測(cè)白血病相關(guān)免疫表型結(jié)合,作為染色體核型正常、無(wú)其他分子生物學(xué)異常標(biāo)記AML患者的MRD監(jiān)測(cè)。同時(shí)本組病例提示AML患者骨髓和外周靜脈血均表達(dá)CDX2基因，且具有高度正相關(guān)，這與李迎俠等[8]研究結(jié)果相同，可用外周靜脈血代替骨髓檢測(cè)CDX2基因表達(dá)。但本研究連續(xù)觀察病例數(shù)量少，CDX2基因作為染色體核型正常AML患者M(jìn)RD監(jiān)測(cè)的臨床意義，外周靜脈血代替骨髓作為MRD監(jiān)測(cè)的可靠性，還有待大宗病例的進(jìn)一步觀察。

[1]Chase A,Reiter A,Burci L,et al.Fusion of ETV6 to the caudal-related homeobox gene CDX2 in acute myeloid leukemia with the t(12;13)(p13;q12)[J].Blood,1999,93(3):1025-1031.

[2]Scholl C,Bansal D,D?hner K,et al.The homeobox gene CDX2 is aberrantly expressed in most cases of acute myeloid leukemia and promotes leukemogenesis[J].J Clin Invest,2007,117(4):1037-1048.

[3]張之南，沈悌．血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M]．天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1991：P116-P121．

[4]潘登．急性髓細(xì)胞白血病預(yù)后因素研究進(jìn)展[J]．癌癥進(jìn)展，2012，10(4)：360-363．

[5]李迎俠CDX2基因與白血病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].國(guó)際兒科學(xué)雜志,2011,38(1):85-87.

[6]陸瀅，汪瓊，牧啟田，等．CDX2基因在初發(fā)急性髓細(xì)胞白血病患者中的表達(dá)及臨床意義[J]．中華血液學(xué)雜志，2012，33(10)：835-838．

[7]黎國(guó)偉，王東寧，葉玉蝶，等．急性髓細(xì)胞白血病CDX2基因表達(dá)及臨床意義的探討[J]．中華腫瘤防治雜志，2009，16(16)：1253-1255．

[8]李迎俠，黃嘉莉，錢(qián)新宏，等．兒童急性白血病CDX2基因WT1基因表達(dá)及其臨床意義對(duì)照研究[J]．中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2013，28(3)：195-199．

Expression and clinical significance of CDX2 gene in adult acute myeloid leukemia*

ShenShuzhen,LiuJuan,MaYun,YangRui,XuFei,LiLing,BaiXiaochuan

(DepartmentofHematology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China)

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of caudal homeobox gene CDX2 in acute myeloid leukemia(AML) patients.MethodsBone marrow (BM)and peripheral blood (PB)samples were colleted in 114 cases of donor AML patients and 56 patients undergoing chemotherapy.The CDX2 gene expression in every patient′s mononuclera cells were detected by RT-PCR.Among these patients,19 cases were detected the gene continuous every three months.Eight healthy PB and five patients with iron deficiency anemia BM as control.ResultsCDX2 gene transcript levels were detectable in bone marrow mononuclear cells from 114 AML patients and 13 healthy donors,but the level of gene expression was higher in AML patients(90/114,78.9%).There was a statistically significant difference between the AML patients and normal donor (P<0.01).The higher or lower expression of CDX2 gene showed no correlation with CR rate.CDX2 gene expression level had a positive correlation in BM and PB mononuclera cells(the correlation coefficientr=0.656,P<0.01).The expression of CDX2 in patients with CR was 10.3%-86.2% of pre-chemotherapy，wihch decreased with the treatment course，while elevated in recurrence. 19 cases of patients underwent half a year of follow-up，there was no significant difference of the rate of early recurrence in two groups(P>0.05).ConclusionHigher expression level of CDX2 gene is mostly in AML patients,but its expression has no relation with CR rate.CDX2 gene may be a prognostic molecular marker in AML patients,and can be used to monitor the minimal residual disease of Normal chromosome karyotype AML.

CDX2;leukemia,myeloid,acute;prognosis;minimal residual disease

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.004

2012年寧夏回族自治區(qū)科技攻關(guān)項(xiàng)目。

：申淑珍(1969-)，碩士，主任醫(yī)師，主要從事血液內(nèi)科專(zhuān)業(yè)工作。

R733.71

A

1671-8348(2015)29-4042-03

2015-04-25

2015-08-16)