王彥斌 ，孫敏嫻，馬文強，鄭 琦(大連市第二人民醫(yī)院消化科，遼寧 大連 116100)

腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，具有自主生長性、移植性、侵襲性及轉(zhuǎn)移性，以侵襲性及轉(zhuǎn)移性最為關(guān)鍵，同時也是判斷腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)，超過80%以上的腫瘤患者死于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［1］。侵襲和轉(zhuǎn)移是緊密相連的兩個階段，關(guān)于對腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面的分子研究很多，1998 年，F(xiàn)uruse 等［2］發(fā)現(xiàn)一類新型的緊密連接蛋白Claudin-1，它主要調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附。有研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-1 的表達(dá)在人類大腸癌組織中比正常組織中明顯上調(diào)，且能調(diào)節(jié)細(xì)胞的侵襲能力。本研究通過抑制SW620 中Claundin-1 的表達(dá)量來觀察Claudin-1 對SW620 細(xì)胞侵襲性和轉(zhuǎn)移性的影響，以進(jìn)一步研究claundin-1 的生物學(xué)習(xí)性。

1 材料

1.1 細(xì)胞株來源

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620 來自美國菌種保藏中心，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。

1.2 Claudin-1 shRNA

自行設(shè)計1 段shRNA 片段及1 段無意義干擾片斷，由上海吉瑪制藥有限公司合成，片段序列及干擾位點見表1。將shRNA 片段進(jìn)行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，命名為SW620-shRNA;無意義的干擾片段作為對照，命名為SW620-control。

表1 shRNA 片段、無意義干擾片斷序列及干擾位點Tab 1 shRNA fragment、meaningless fragments of interference sequence and interference locus

1.3 儀器與試藥

CO2培養(yǎng)箱(型號3427，美國Thermo 公司);電泳儀、電泳槽(美國Bio-Rad 公司)。Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司;兔抗人Claudin-1 抗體、山羊抗兔抗體(美國Cell Signaling Technology 公司);10%胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco 公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SW620 細(xì)胞在含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，1 周2 次。

2.2 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SW620 細(xì)胞

用Lipofectamine 2000 將質(zhì)粒導(dǎo)入SW620 細(xì)胞。具體步驟:將SW620 細(xì)胞消化下來，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1 ×105/ml，以2 ml/孔接種入6 孔板，用無抗菌藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)16 ～24 h以上至細(xì)胞密度達(dá)到75%左右。撤去原培養(yǎng)液，以1 ×磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕沖洗3 遍，以2 ml/孔加入Opti-MEN Ⅰ溶液。加入質(zhì)粒后，將其置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h 后更換無抗菌藥物的含10% 胎牛血清的PRMI-1640 培養(yǎng)液，48 h 后用含遺傳霉素(G418)的10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液篩選。待形成陽性單細(xì)胞克隆群落后，用尖吸管吸取單克隆陽性細(xì)胞培養(yǎng)。

2.3 免疫蛋白質(zhì)印跡法(western blot，WB)檢測Claudin-1蛋白表達(dá)水平

恒壓80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠，把電壓提高至120 V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部;半干電轉(zhuǎn)移，以5%的脫脂奶粉/TBS-T 緩沖液封閉聚偏二氟乙烯(PVDF)膜2 h，室溫(25 ℃)下輕柔搖動;以5%的脫脂奶粉/TBS-T 緩沖液稀釋相應(yīng)的一抗(1 ∶1 000 μl)，與PVDF 膜4 ℃孵育過夜;以TBS-T 緩沖液洗滌5 min、3 次。二抗與一抗結(jié)合:以5%的脫脂奶粉/TBS-T 緩沖液稀釋相應(yīng)的二抗(1∶5 000 μl)，與PVDF 膜孵育1 h，室溫(25 ℃)下輕柔搖動;以TBS-T 緩沖液洗滌5 min、3 次;以TBS 緩沖液再洗滌5 min。增強化學(xué)發(fā)光顯影，用UVI 凝膠成像系統(tǒng)攝像，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析條帶灰度值。

2.4 細(xì)胞侵襲試驗

待測細(xì)胞各組，每組設(shè)4 個孔;取細(xì)胞對數(shù)生長期，用無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液過夜;按說明書鋪基質(zhì)膠;消化下細(xì)胞后，用PBS 調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×106/ml;在上、下室分別加入100 μl 細(xì)胞懸液和500 μl 含10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液，于37 ℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)48 h;取出上室，除去膜上室面的基質(zhì)膠和細(xì)胞，以4%多聚甲醛固定膜下室面的細(xì)胞15 min;以結(jié)晶紫染色10 min，取下風(fēng)干后，以中性樹脂封固。在400 ×高倍鏡下，每張膜取上、下、左、右、中5 個視野計數(shù)。

2.5 動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移試驗

實驗動物:4 ～6 周齡的Balb/c 裸鼠36 只，雄性，體質(zhì)量(19 ±2)g，隨機(jī)分為2 組，分別為SW620-shRNA 組和SW620-control 組，每組各18 只，均置于SPF 環(huán)境下飼養(yǎng)。構(gòu)建脾臟保留法制備裸鼠肝轉(zhuǎn)移模型，2 組裸鼠分別注射含5 × 106SW620-shRNA 或SW620-control 的細(xì)胞懸液50 μl。術(shù)后繼續(xù)在SPF 條件下飼養(yǎng)。病理觀察:接種后4 周處死裸鼠，打開腹腔，觀察脾臟和肝臟有無轉(zhuǎn)移，記錄肝臟表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量，所有轉(zhuǎn)移瘤均經(jīng)病理切片蘇木精-伊紅染色證實。根據(jù)肝表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)目分為4 個等級:0 級，肝臟無轉(zhuǎn)移病灶;Ⅰ級，1 ～3 個轉(zhuǎn)移病灶;Ⅱ級:3 ～5 個轉(zhuǎn)移病灶;Ⅲ級:＞5 個轉(zhuǎn)移病灶。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)抑制Claudin-1 的表達(dá)水平

采用WB 檢測應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)抑制Claudin-1 的表達(dá)水平，結(jié)果見圖1。

圖1 WB 檢測Claudin-1 的表達(dá)水平Fig 1 Results of the expression level of Claudin-1 determined by Westen blot

3.2 抑制Claudin-1 的表達(dá)后對細(xì)胞侵襲能力的影響

采用穿膜侵襲試驗檢測SW620-shRNA 與SW620-control細(xì)胞對基質(zhì)膠侵襲能力的差異，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，SW620-control 組的細(xì)胞比SW620-shRNA 組更具有侵襲力，抑制率高達(dá)70%，差異極有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。

圖2 下調(diào)Claudin-1 表達(dá)水平對SW620 細(xì)胞侵襲性的抑制結(jié)果Fig 2 Inhibition results of SW620 cells invasion after the down-regulation of expression level of Claudin-1

3.3 抑制Claudin-1 的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞在裸鼠中轉(zhuǎn)移能力的影響

抑制Claudin-1 的表達(dá)后，不僅明顯抑制了SW620 細(xì)胞在裸鼠中的轉(zhuǎn)移，而且減少了轉(zhuǎn)移灶的形成，見表2。

表2 抑制Claudin-1 的表達(dá)對SW620 細(xì)胞裸鼠肝臟轉(zhuǎn)移能力的影響Tab 2 Effect of inhibiting Claudin-1 expression on SW620 cells in liver metastasis capacity of nude mice

4 討論

Claudin-1 為位于人染色體3q28-q29 的基因，編碼211 個氨基酸，主要參與細(xì)胞間的黏附調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-1 在不同腫瘤中的表達(dá)有明顯差異，如其在乳腺癌［3-4］、肺腺癌［5］中以低表達(dá)的形式促進(jìn)腫瘤的發(fā)病，而在其他腫瘤細(xì)胞如腎細(xì)胞癌、卵巢癌、胃腸道腫瘤中卻以過表達(dá)的形式促進(jìn)疾病發(fā)展［6-12］。

惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為原發(fā)灶的惡性腫瘤細(xì)胞侵襲鄰近組織或轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處，并進(jìn)一步生長形成轉(zhuǎn)移灶，其發(fā)生的過程建立在穿透基底膜的基礎(chǔ)上。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制Claudin-1 的表達(dá)后，SW620 細(xì)胞穿透基底膜的能力明顯降低，其抑制率達(dá)到70%左右，說明Claudin-1 能夠明顯影響腫瘤的侵襲能力。隨后，本研究建立了具有與患者相似轉(zhuǎn)移途徑的小鼠體內(nèi)人結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，并且保留了原細(xì)胞系的生物學(xué)特征，結(jié)果顯示，抑制Claudin-1 的表達(dá)能阻止SW620 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生，其在表面轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)數(shù)遠(yuǎn)低于SW620-control 組。本研究結(jié)果證明，Claudin-1 可以影響腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力，同時，其有利于闡明大腸癌侵襲的分子機(jī)制，對臨床上預(yù)測腫瘤惡性程度、進(jìn)行靶向治療的意義重大。

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