李小玲+華智銳

摘要：為研究了春蘭（Cymbidium goeringii）基因組DNA的最佳提取方法，以商洛野生春蘭為試驗(yàn)材料，分別采用SDS法、CTAB法、高鹽CTAB法提取了春蘭基因組DNA。結(jié)果表明，高鹽CTAB法提取效果較好，其次是CTAB法，SDS法提取效果最差。

關(guān)鍵詞：春蘭（Cymbidium goeringii）;DNA提取;濃度;純度

中圖分類號(hào)：Q943.2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）12-2923-02

Comparative Studies on Extracting Genome DNA of Cymbidium goeringii

LI Xiao-ling，HUA Zhi-rui

（Department of Biomedical Medicine Engineering，Shangluo University，Shangluo 726000，Shaanxi，China）

Abstract： To explore the optimal genomic DNA extraction method of Cymbidium goeringii，with wild Cymbidium goeringii in Shangluo as experimental material， genomic DNA of wild Cymbidium goeringii has been extracted by the method of SDS，CTAB and high salt CTAB. The results showed that high salt CTAB was the best of three methods， followed by CTAB and SDS.

Key words： Cymbidium goeringii;DNA extraction;concentration;purity

春蘭（Cymbidium goeringii）又名草蘭、山蘭，是國(guó)蘭中栽培與觀賞歷史最為悠久的種類之一。目前，對(duì)春蘭的研究主要集中在組織培養(yǎng)[1，2]、栽培[3]、非共生萌發(fā)[4]和共生菌[5，6]等方面，而對(duì)春蘭分子遺傳學(xué)方面的研究報(bào)道較少[1，7]。獲得高質(zhì)量的基因組DNA是分子遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)。蘭科植物組織細(xì)胞中含有大量酚類、多糖等次生代謝產(chǎn)物，給基因組DNA的提取造成了困難。酚類物質(zhì)容易氧化，氧化后與DNA形成共價(jià)結(jié)合而導(dǎo)致DNA褐變，引起DNA的丟失;多糖類物質(zhì)容易與DNA產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致DNA樣品的流失[8]。本研究采用SDS法、CTAB法、高鹽CTAB法[1，7]提取商洛野生春蘭基因組DNA，探索最適合春蘭基因組DNA的提取方法，旨在為今后春蘭種質(zhì)資源學(xué)及其種群遺傳結(jié)構(gòu)研究提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?春蘭的采集與預(yù)處理 ?試驗(yàn)材料采于商洛市板橋鎮(zhèn)下彎村海拔約750 m處的林下陰坡，將采回的蘭花種于花盆中并放置陰涼處備用。DNA提取前1 d，剪取健康完整的春蘭幼嫩葉片，將葉片上殘留的雜質(zhì)用去離子水沖洗干凈，用濾紙將水吸干，待室溫晾干后用滅過(guò)菌的剪刀將蘭花剪成碎片，用紙包好，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.1.2 ?主要試劑 ?三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、硼酸（Boric acid）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、溴化十二烷基三甲基銨（CTAB）、瓊脂糖、超純水、溴化乙錠（EB）、氯仿、異戊醇、濃鹽酸、固體氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水乙醇、β-巰基乙醇均購(gòu)自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 ?主要儀器 ?高壓蒸汽滅菌鍋、HNZ-2-2F型垂直流行超凈工作臺(tái)（上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠監(jiān)制，南通滬南科學(xué)儀器有限公司制造）;FA2004N型電子天平、U755B型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司制造）;H2050R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio·Rad公司）等。

1.2 ?方法

1.2.1 ?基因組DNA的提取 ?①稱取0.2 g春蘭葉片，用去離子水沖洗干凈，并用濾紙吸干水分。②將葉片剪成1 cm左右碎片，放入預(yù)冷的瓷研缽中，迅速加入液氮，將植物材料研磨成細(xì)粉（越細(xì)越好）并迅速轉(zhuǎn)入2 mL離心管中。③在2 mL離心管中加入3種預(yù)熱的抽提緩沖液1 mL，65 ℃保溫1 h，保溫期間應(yīng)該輕輕顛倒搖勻。④用高速冷凍離心機(jī)15 000 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中，用移液器轉(zhuǎn)移上清液時(shí)應(yīng)緩慢，防止將沉淀吸入。⑤加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），混勻抽提至水乳膠融狀，用高速冷凍離心機(jī)15 000 r/min離心10 min。⑥將上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中。加入等體積-20 ℃預(yù)冷無(wú)水乙醇，-20 ℃靜置45 min，緩緩混勻DNA成絮狀折出。⑦用高速冷凍離心機(jī)15 000 r/min離心10 min，緩慢棄上清液。DNA沉淀用70%乙醇洗2次，室溫風(fēng)干。洗滌時(shí)用移液器沿離心管的管壁緩慢注入，防止將DNA沖洗下來(lái)。⑧加入100 μL的TE緩沖液，室溫下溶解DNA至沉淀完全消失，-20 ℃靜置保存。

1.2.2 ?基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) ?配制1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)基因組DNA，并采用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相并保存。endprint

1.2.3 ?紫外分光光度法檢測(cè)DNA的濃度和純度 ? ?分別測(cè)定基因組DNA在260 nm、280 nm時(shí)的吸光度。每次換待測(cè)樣品時(shí)，必須調(diào)零。計(jì)算待測(cè)樣品的濃度與純度。

根據(jù)A260 nm=1時(shí)，dsDNA濃度約為50 μg/mL，DNA濃度計(jì)算公式為：DNA濃度（μg/mL）=A260 nm×50 μg/mL×稀釋倍數(shù)。

春蘭基因組DNA提取率以每克鮮重春蘭葉片提取到的基因組DNA的微克數(shù)表示，DNA提取率計(jì)算公式為：提取率=DNA濃度×體積/樣重。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?商洛野生春蘭基因組DNA電泳結(jié)果

采用SDS法、CTAB法、高鹽CTAB法3種方法提取春蘭基因組DNA后，將提取到的基因組DNA 以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，3種方法均能提取到基因組DNA，點(diǎn)樣孔附近白色的片段為基因組DNA?；蚪MDNA比較大，所以在凝膠中遷移的速率較慢，其中泳道5～泳道12的基因組DNA明顯比泳道1～泳道4更大、更亮，說(shuō)明CTAB法和高鹽CTAB法提取到的基因組DNA比SDS法提取的濃度更高，即SDS法效果較差。3種方法所提取的基因組DNA的電泳條帶均有輕微的拖尾現(xiàn)象，原因可能是春蘭材料在儲(chǔ)存和操作過(guò)程中產(chǎn)生了DNA的部分降解，從圖1可以明顯看出，基因組DNA有部分降解為約2 000 bp大小的DNA片段。

2.2 ?紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和提取率結(jié)果

采用SDS法、CTAB法、高鹽CTAB法3種方法提取春蘭基因組DNA后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在260 nm和280 nm的吸光度，計(jì)算出DNA濃度和DNA提取率，結(jié)果如表1所示。

純度高的DNA A260 nm/A280 nm在1.7～1.9之間，當(dāng)A260 nm/A280 nm為1.8時(shí)，純度最高。低于此范圍表明所提取的DNA有蛋白質(zhì)、酚類污染;高于此范圍表明樣品中含有RNA污染。

由表1可知，SDS法、CTAB法、高鹽CTAB法提取的DNA A260 nm/A280 nm分別為1.576、1.654、1.835。高鹽CTAB法提取的DNA純度較高，而SDS法和CTAB法的A260 nm/A280 nm均小于1.8，表明有蛋白質(zhì)污染，且SDS法提取到的基因組DNA污染較嚴(yán)重。3種方法提取到的DNA的濃度為高鹽CTAB法>CTAB法>SDS法;DNA的提取率為高鹽CTAB法>CTAB法>SDS法。

綜合比較，高鹽CTAB法提取效果較好，其次是CTAB法，最差的是SDS法。

3 ?小結(jié)與討論

植物體內(nèi)的組織和器官含有酚類、多糖類、色素類等物質(zhì)，在植物基因組DNA提取過(guò)程中容易受到這些物質(zhì)的干擾。酚類雜質(zhì)的存在，氧化后會(huì)絡(luò)合DNA分子，產(chǎn)生褐色雜質(zhì);多糖類雜質(zhì)會(huì)粘連DNA分子，形成膠狀復(fù)合物，導(dǎo)致DNA難以溶解。3種方法所提取的DNA電泳條帶均有輕微的拖尾現(xiàn)象，原因可能是春蘭材料在儲(chǔ)存和操作過(guò)程中產(chǎn)生了DNA部分降解，降解的原因很多，如外界物理因素（溫度、濕度）。本研究用3種方法提取商洛野生春蘭基因組DNA，通過(guò)比較初步得出高鹽CTAB法優(yōu)于CTAB法和SDS法，對(duì)于春蘭基因組DNA提取方法的具體優(yōu)化方面還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉 ?陽(yáng)，陳小強(qiáng)，孫 ?寧，等.大花蕙蘭子房基因組DNA提取方法的比較研究[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，19（2）：14-18.

[2] 陳惠云，孫志棟，茅軼俊，等.春蘭基因組DNA提取方法的研究[J].分子植物育種，2006，4（1）：135-142.

[3] 周 ?全，余 ?平.春蘭根狀莖的增殖與分化條件優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（1）：27-30.

[4] 王永清，余道平.春蘭根狀莖離體培養(yǎng)[J].園藝學(xué)報(bào)，2005（4）：706-706.

[5] 趙 ?虎，封 ?宸，邢 ?海，等.春蘭提前開(kāi)花的栽培試驗(yàn)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（1）：37-38.

[6] 李 ?麗，羅君琴，王海琴.春蘭種子非共生萌發(fā)的研究[J].福建熱作科技，2007（3）：127-130.

[7] 司更花，朱國(guó)鵬.五唇蘭基因組DNA提取方法的優(yōu)化[J].熱帶林業(yè)，2012，40（2）：37-39.

[8] 梁紅健，劉 ?敏，林 ?鳴.中國(guó)蘭花（Chinese Cymbidium）部分品種的葉片同工酶分析[J].生物實(shí)驗(yàn)學(xué)報(bào)，1997（3）：343-348.endprint

1.2.3 ?紫外分光光度法檢測(cè)DNA的濃度和純度 ? ?分別測(cè)定基因組DNA在260 nm、280 nm時(shí)的吸光度。每次換待測(cè)樣品時(shí)，必須調(diào)零。計(jì)算待測(cè)樣品的濃度與純度。

根據(jù)A260 nm=1時(shí)，dsDNA濃度約為50 μg/mL，DNA濃度計(jì)算公式為：DNA濃度（μg/mL）=A260 nm×50 μg/mL×稀釋倍數(shù)。

春蘭基因組DNA提取率以每克鮮重春蘭葉片提取到的基因組DNA的微克數(shù)表示，DNA提取率計(jì)算公式為：提取率=DNA濃度×體積/樣重。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?商洛野生春蘭基因組DNA電泳結(jié)果

采用SDS法、CTAB法、高鹽CTAB法3種方法提取春蘭基因組DNA后，將提取到的基因組DNA 以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，3種方法均能提取到基因組DNA，點(diǎn)樣孔附近白色的片段為基因組DNA?；蚪MDNA比較大，所以在凝膠中遷移的速率較慢，其中泳道5～泳道12的基因組DNA明顯比泳道1～泳道4更大、更亮，說(shuō)明CTAB法和高鹽CTAB法提取到的基因組DNA比SDS法提取的濃度更高，即SDS法效果較差。3種方法所提取的基因組DNA的電泳條帶均有輕微的拖尾現(xiàn)象，原因可能是春蘭材料在儲(chǔ)存和操作過(guò)程中產(chǎn)生了DNA的部分降解，從圖1可以明顯看出，基因組DNA有部分降解為約2 000 bp大小的DNA片段。

2.2 ?紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和提取率結(jié)果

采用SDS法、CTAB法、高鹽CTAB法3種方法提取春蘭基因組DNA后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在260 nm和280 nm的吸光度，計(jì)算出DNA濃度和DNA提取率，結(jié)果如表1所示。

純度高的DNA A260 nm/A280 nm在1.7～1.9之間，當(dāng)A260 nm/A280 nm為1.8時(shí)，純度最高。低于此范圍表明所提取的DNA有蛋白質(zhì)、酚類污染;高于此范圍表明樣品中含有RNA污染。

由表1可知，SDS法、CTAB法、高鹽CTAB法提取的DNA A260 nm/A280 nm分別為1.576、1.654、1.835。高鹽CTAB法提取的DNA純度較高，而SDS法和CTAB法的A260 nm/A280 nm均小于1.8，表明有蛋白質(zhì)污染，且SDS法提取到的基因組DNA污染較嚴(yán)重。3種方法提取到的DNA的濃度為高鹽CTAB法>CTAB法>SDS法;DNA的提取率為高鹽CTAB法>CTAB法>SDS法。

綜合比較，高鹽CTAB法提取效果較好，其次是CTAB法，最差的是SDS法。

3 ?小結(jié)與討論

植物體內(nèi)的組織和器官含有酚類、多糖類、色素類等物質(zhì)，在植物基因組DNA提取過(guò)程中容易受到這些物質(zhì)的干擾。酚類雜質(zhì)的存在，氧化后會(huì)絡(luò)合DNA分子，產(chǎn)生褐色雜質(zhì);多糖類雜質(zhì)會(huì)粘連DNA分子，形成膠狀復(fù)合物，導(dǎo)致DNA難以溶解。3種方法所提取的DNA電泳條帶均有輕微的拖尾現(xiàn)象，原因可能是春蘭材料在儲(chǔ)存和操作過(guò)程中產(chǎn)生了DNA部分降解，降解的原因很多，如外界物理因素（溫度、濕度）。本研究用3種方法提取商洛野生春蘭基因組DNA，通過(guò)比較初步得出高鹽CTAB法優(yōu)于CTAB法和SDS法，對(duì)于春蘭基因組DNA提取方法的具體優(yōu)化方面還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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[8] 梁紅健，劉 ?敏，林 ?鳴.中國(guó)蘭花（Chinese Cymbidium）部分品種的葉片同工酶分析[J].生物實(shí)驗(yàn)學(xué)報(bào)，1997（3）：343-348.endprint

1.2.3 ?紫外分光光度法檢測(cè)DNA的濃度和純度 ? ?分別測(cè)定基因組DNA在260 nm、280 nm時(shí)的吸光度。每次換待測(cè)樣品時(shí)，必須調(diào)零。計(jì)算待測(cè)樣品的濃度與純度。

根據(jù)A260 nm=1時(shí)，dsDNA濃度約為50 μg/mL，DNA濃度計(jì)算公式為：DNA濃度（μg/mL）=A260 nm×50 μg/mL×稀釋倍數(shù)。

春蘭基因組DNA提取率以每克鮮重春蘭葉片提取到的基因組DNA的微克數(shù)表示，DNA提取率計(jì)算公式為：提取率=DNA濃度×體積/樣重。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?商洛野生春蘭基因組DNA電泳結(jié)果

采用SDS法、CTAB法、高鹽CTAB法3種方法提取春蘭基因組DNA后，將提取到的基因組DNA 以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，3種方法均能提取到基因組DNA，點(diǎn)樣孔附近白色的片段為基因組DNA?；蚪MDNA比較大，所以在凝膠中遷移的速率較慢，其中泳道5～泳道12的基因組DNA明顯比泳道1～泳道4更大、更亮，說(shuō)明CTAB法和高鹽CTAB法提取到的基因組DNA比SDS法提取的濃度更高，即SDS法效果較差。3種方法所提取的基因組DNA的電泳條帶均有輕微的拖尾現(xiàn)象，原因可能是春蘭材料在儲(chǔ)存和操作過(guò)程中產(chǎn)生了DNA的部分降解，從圖1可以明顯看出，基因組DNA有部分降解為約2 000 bp大小的DNA片段。

2.2 ?紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和提取率結(jié)果

采用SDS法、CTAB法、高鹽CTAB法3種方法提取春蘭基因組DNA后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在260 nm和280 nm的吸光度，計(jì)算出DNA濃度和DNA提取率，結(jié)果如表1所示。

純度高的DNA A260 nm/A280 nm在1.7～1.9之間，當(dāng)A260 nm/A280 nm為1.8時(shí)，純度最高。低于此范圍表明所提取的DNA有蛋白質(zhì)、酚類污染;高于此范圍表明樣品中含有RNA污染。

由表1可知，SDS法、CTAB法、高鹽CTAB法提取的DNA A260 nm/A280 nm分別為1.576、1.654、1.835。高鹽CTAB法提取的DNA純度較高，而SDS法和CTAB法的A260 nm/A280 nm均小于1.8，表明有蛋白質(zhì)污染，且SDS法提取到的基因組DNA污染較嚴(yán)重。3種方法提取到的DNA的濃度為高鹽CTAB法>CTAB法>SDS法;DNA的提取率為高鹽CTAB法>CTAB法>SDS法。

綜合比較，高鹽CTAB法提取效果較好，其次是CTAB法，最差的是SDS法。

3 ?小結(jié)與討論

植物體內(nèi)的組織和器官含有酚類、多糖類、色素類等物質(zhì)，在植物基因組DNA提取過(guò)程中容易受到這些物質(zhì)的干擾。酚類雜質(zhì)的存在，氧化后會(huì)絡(luò)合DNA分子，產(chǎn)生褐色雜質(zhì);多糖類雜質(zhì)會(huì)粘連DNA分子，形成膠狀復(fù)合物，導(dǎo)致DNA難以溶解。3種方法所提取的DNA電泳條帶均有輕微的拖尾現(xiàn)象，原因可能是春蘭材料在儲(chǔ)存和操作過(guò)程中產(chǎn)生了DNA部分降解，降解的原因很多，如外界物理因素（溫度、濕度）。本研究用3種方法提取商洛野生春蘭基因組DNA，通過(guò)比較初步得出高鹽CTAB法優(yōu)于CTAB法和SDS法，對(duì)于春蘭基因組DNA提取方法的具體優(yōu)化方面還有待進(jìn)一步研究。

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[8] 梁紅健，劉 ?敏，林 ?鳴.中國(guó)蘭花（Chinese Cymbidium）部分品種的葉片同工酶分析[J].生物實(shí)驗(yàn)學(xué)報(bào)，1997（3）：343-348.endprint